方法。作者手稿；PMC 2009年12月1日提供。
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线粒体基因组随机突变的量化
华盛顿大学病理学系，西雅图，98195华盛顿，美国
手稿编辑信函Marc Vermulst，威斯康星州医学院病理学系，1959 NE Pacific Street，Health Science Building K-058，Box 357705，电话：（206）543-0557，电子邮件：ude.notgnihsaw.u@evm，出版后通信劳伦斯·A·勒布（Lawrence A.Loeb），威斯康星州医学院病理学系，1959 NE Pacific Street，Health Science Building K-072，Box 357705，电话：（206）543-6015，电子邮件：ude.notgnihsaw.u@beolal先生 摘要
线粒体DNA（mtDNA）突变与包括帕金森病在内的许多与年龄相关的疾病的病理学有关(1,2)、肌肉铸型(三)以及癌症的转移潜能(4). 线粒体DNA突变对多种人类疾病的影响使得理解线粒体突变的驱动机制变得越来越重要。为了对线粒体DNA突变的病因学和自然史提供新的见解，我们开发了一种检测方法，可以检测各种组织和实验环境中的线粒体突变(5,6). 这种称为随机突变捕获分析的方法依赖于单分子扩增来检测数百万野生型碱基中的罕见突变(7)，并可用于分析哺乳动物中单碱基对水平的线粒体突变。
关键词：线粒体，线粒体DNA，突变，突变，qPCR，突变检测
1.简介
由于缺乏高度敏感的突变检测试验，我们对线粒体突变的理解受到了阻碍(8). 相反，许多检测方法可用于检测核DNA的体细胞突变(9-11). 一些信息最丰富的检测采用了含有报告基因（如LacZ）的转基因小鼠模型(12)或EYFP(13)这使得研究人员能够以时间依赖的方式仔细跟踪突变行为。不幸的是，我们目前缺乏随意操纵线粒体基因组序列的能力，这妨碍了我们在线粒体基因组中插入突变报告子或可选标记。对氯霉素的耐药性可用于对16SrRNA亚单位的mtDNA突变进行评分(14)但对增殖细胞的要求限制了该检测方法的使用，使其仅限于可在培养中扩增的细胞类型。此外，重要的是要指出，由于细胞内线粒体DNA分子的多样性，抗性突变需要克隆性扩增，才能对整个细胞产生抗性。克隆扩展的需要给数据分析增加了一层复杂性，这使得很难定义线粒体DNA突变率和谱等关键参数，而这些参数是充分了解线粒体突变在人类疾病中的作用所必需的。为了定义这些参数，我们需要能够检测到自发突变，这是在基因组中随机发生的罕见事件。检测突变最直接的方法是测序。不幸的是，出现了突变从头开始不容易通过测序检测，因为它们只存在于线粒体DNA的一个拷贝中，而要通过测序来检测，突变必须存在于10-25%的分子群体中(15). 解决这个问题的一个方法，仍然使用测序作为检测方法，就是分别对每个mtDNA分子进行测序。为了做到这一点，已经设计了几种分析方法，所有这些方法都是在测序之前分离并扩增单个DNA分子(16-19). 然而，重要的是，测序前单个DNA分子的扩增可能会在扩增过程中产生虚假突变。这可能是文献中对哺乳动物组织线粒体DNA突变频率没有达成共识的原因之一。测量的频率在很大程度上取决于所用分析的背景(20). 这种差异表明线粒体DNA的自发突变频率低于或非常接近这些技术的检测极限。为了解决这一争议，我们采用了一种高灵敏度的单分子测序方法，称为随机突变捕获（RMC）分析，以测量哺乳动物mtDNA的自发突变频率(6).
2.RMC分析的概念
虽然RMC分析最初是为了量化核基因组的突变(7)它被设计为使用DNA作为其源材料，因此，原则上，该方法可以应用于任何生物体或所需的DNA，而对方案的更改最小。在这里，我们描述了我们如何调整协议来测量线粒体基因组的突变。
该检测围绕限制性内切酶进行，Taq公司一、 用于区分WT DNA和罕见的DNA分子，这些DNA分子在TaqI公司限制站点。通过消化线粒体基因组塔克一、 绝大多数线粒体DNA分子将在已知的限制位点被裂解(). 然而，少数分子会抵抗塔克我因限制位点突变而分裂。该检测背后的关键思想是，可以使用限制性位点侧翼的引物，通过实时PCR对这些分子进行定量。因此，PCR可用于筛选大量mtDNA分子，以发现罕见的突变拷贝。筛选的分子数量通过第二个PCR反应来确定，该反应放大了邻近但不受塔克我限制网站。为了增加可筛选的分子数量，PCR扩增以96 well格式进行。下面给出了如何使用此信息计算突变频率的一个示例使用96 well板还可以在单分子水平上对突变分子进行定量。然后对这些分子进行测序，以验证塔克我限制网站。因此，像其他使用蛮力同时对多个单分子进行测序的分析一样，RMC分析最终是一种单分子测序方法。关键区别在于，RMC分析不是对样本中的每个DNA分子进行PCR扩增和测序，而是在PCR扩增之前插入一个简单的DNA消化步骤，以便从进一步分析中去除WT分子。这确保了只有已知含有突变的分子才需要测序，大大加快了突变发现的过程并降低了成本。此外，由于突变分子的基因型选择发生在PCR扩增之前，突变发现与PCR扩增的保真度脱节，这大大提高了检测的灵敏度。
随机突变捕获分析的概念RMC分析利用了塔克一、 一种限制酶，用于区分具有WT或突变的DNA分子塔克我限制网站。线粒体DNA消化后塔克一、 尝试在塔克I限制站点（红色箭头）。这种PCR反应将只扩增限制性位点（红盒）中含有突变的DNA分子，使其对切割具有抵抗力。带有WT限制位点（绿色框）的扩增子不再是PCR扩增的模板。然后通过qPCR对这些突变分子进行量化。与限制位点相邻的第二个qPCR反应对样本中的每个DNA分子进行定量。突变分子与总分子数的比率是突变频率的直接测量值，可用于计算每个碱基对的突变频率。
随机突变捕获分析示意图RMC分析包括4个步骤，细胞器分离、DNA提取、DNA消化和qPCR扩增。为了计算突变频率，mtDNA以96-well格式显示。在上面给出的例子中，10000个线粒体基因组分子被插入B-H行。在这些孔中的每一个中，试图在塔克我限制网站。图中，9个以红色显示的微孔中含有一个放大的分子。对每一个PCR反应进行测序，证实TaqI限制位点存在突变。A排中从10000份到1份的连续稀释液用于确认每口井中的拷贝数，并对PCR效率进行重要控制。估计每孔1个拷贝（孔A5-A11），一些孔有，一些孔不包含扩增的DNA分子。突变频率可计算如下：；如果每个孔筛选10000个mtDNA拷贝，这相当于每个孔筛选40000个碱基对，因为塔克I位点长4bps，这些碱基对中的任何一个发生突变都会使其抗分裂。本实验共筛选出84口井，共计3.36×10口6已筛选个基点。发现9个突变株，突变频率为2.6×10-6.
3.随机突变捕获分析的描述
以下各节将描述用于执行随机突变捕获分析的方法。分析包括4个基本步骤，如前两步，细胞器分离和DNA提取将允许您在有限的核DNA污染情况下分离线粒体DNA。然后，用塔克I限制性内切酶和qPCR-扩增用于测量突变频率。下面详细描述了每个步骤。
3.1器官分离
RMC分析的一个重要要求是从纯化mtDNA的制备开始。核DNA（nDNA）污染可导致限制性内切酶对线粒体DNA的不完全消化，并增加PCR效率的变化。此外，细胞核中存在大量线粒体假基因，可通过线粒体DNA特异性引物进行PCR扩增。其中一些假基因在塔克I限制性位点，可能被错误地记为突变。限制nDNA污染的一种方法是在提取DNA之前分离线粒体，以便将核DNA排除在进一步分析之外。最好的线粒体制剂来自新鲜组织。因此，建议尽可能使用新鲜组织或细胞培养物，尽管可以使用快速冷冻组织。如果要从小鼠身上获取组织，则需要尽快提取器官，并立即将其置于冰上，以阻止组织退化。
3.1.2从组织中提取线粒体
有几种方法可用于溶解细胞和获取线粒体，市面上有许多试剂盒（Pierce，cat.#89801和#89874）。大多数方法使用差速离心分离线粒体和细胞核。本节将描述如何使用自制试剂盒进行差速离心，并基于之前在方法(21). 该过程首先用Dounce均质器打碎细胞膜，然后轻轻旋转含有细胞核和细胞碎片的颗粒。线粒体存在于上清液中，通过高速离心回收。
为了裂解细胞，组织需要在保持线粒体完整的缓冲液中匀浆。针对不同的组织，建议使用特定的缓冲液。对于肝脏和肾脏，该缓冲液含有0.32M蔗糖、1mM EDTA和10mM Tris-HCl，pH 7.4。对于大脑和心脏组织，缓冲液由0.075M蔗糖、0.225M山梨醇、1mM EGTA、0.1%无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）和10mM Tris-HCl组成，pH 7.4。每克肝脏使用4ml均质缓冲液，肾脏或大脑使用5ml/g，心脏使用10ml/g。均质之前，应在1×PBS的冰凉溶液或适当的均质缓冲液中清洗样品，以去除血液和结缔组织。确保组织保持低温，使用手术刀或剃须刀将组织切成小块，并清除组织内的血块。然后，使用手动玻璃杵将组织均匀化，用力敲打约10下，直到大的组织块分散，让细胞膨胀2分钟，然后再用杵再敲打10下，以完成均匀化过程。在显微镜下监测过程时，当70%的细胞被溶解时，应停止均质化。将匀浆转移至10ml试管中，并在1000克在4°C下放置10分钟，以使细胞核和大细胞碎片颗粒化。将上清液收集在1.5毫升Eppendorf管中，并在4°C下以13000 rpm离心15分钟，以获得线粒体颗粒。通过以4000 rpm而不是13000 rpm离心，颗粒中溶酶体和过氧化物酶体的污染可以减少50%。然而，这会降低线粒体产量。去除上清液，并用750μl冰镇均质缓冲液在单管中重新悬浮颗粒。在4°C下，以13000 rpm的转速再次旋转线粒体部分10分钟。去除上清液，并将颗粒重新悬浮在含有10mM Tris-HCl、0.15M NaCl和0.05M EDTA的650μl裂解缓冲液中。
3.2 MtDNA提取
向最终浓度为0.2mg/ml的裂解缓冲液中添加蛋白酶K，并将SDS添加至最终浓度为0.5%。将样品在55°C下孵育30分钟，以溶解线粒体。可以添加RNaseA以30ng/ml的最终浓度水解RNA。然后可以通过酚氯仿提取分离DNA，然后进行乙醇沉淀(22). 将酚氯异戊醇（25:24:1体积比）以1:1的比例加入裂解反应中，摇晃充分混合，以13000rpm离心2分钟。轻轻地从溶液顶部去除水相，但不要干扰界面。如果界面不稳定，切断移液管尖端的末端，以减少移液力。再次将水溶液与酚氯异戊醇以1:1的比例混合，并重复萃取。仅用氯仿以1:1的比例进行最后一次萃取，以去除任何微量的苯酚。向最终提取物中添加1:20体积比的3M醋酸钠和2μl浓度为10μg/ml的糖原，以促进DNA沉淀。将冰镇的100%乙醇以2.5:1的体积比加入溶液中，摇匀。样品在-80°C下储存15分钟，或在-20°C下保存30分钟。然后，在4°C下，以13000rpm离心样品30分钟，以沉淀mtDNA。用70%乙醇冲洗颗粒表面，然后在4°C下再次离心5分钟。去除乙醇和空气干燥样品15分钟，然后将颗粒重新悬浮在10mM Tris-HCl中。此时，可以确定核DNA污染的数量。最精确的方法是使用核靶点和线粒体靶点进行实时PCR。许多经验证的引物可用于扩增核DNA，网址为http://www.realtimeprimers.org，我们推荐的两个素数集可以在中找到如果nDNA污染程度高，导致线粒体DNA消化不完全塔克I或破坏有效的DNA扩增，我们建议在差速离心后使用蔗糖梯度纯化来进一步分离线粒体。Yoon等人(23).
表1
| 小鼠RMC分析 |
| mControl转发：TCGGCGTTAAAACGTGTCAAC |
| m控制反转：CCGCCAAGTCTTTGAGTTT |
| mTaq634转发：ACTCAAAGGACTTGGCGGTA |
| mTaq634反面：AGCCAATTTCTTCCCATTTC |
| 小鼠核DNA污染 |
| nDNA转发：ATGGAAAGCTCCATG |
| nDNA反向：TCCTTGTTGTTCAGCATCAC |
| mtDNA转发：CCTATCACCTTGCCCAT |
| mtDNA反转：GAGGCTGTGCTTGTGAC |
| 人RMC分析 |
| hcontrol转发：ACAGTTTATGTAGCTTACCTCC |
| h反向控制：TTGCTGCGTGCTTGATGCTTG |
| hTaq1216转发：AACTGCTCCAGAAACACTAC |
| hTaq1216反面：GGGCTACACCTTGACCTAAC |
| 人类核DNA污染 |
| nDNA转发：CCCCATGAAAACTCTTTTT |
| nDNA背面：GAAAACTGAGAAATCGGGT |
| mtDNA转发：CATAGGAGGCTTCATCACTG |
| mtDNA反转：CAGGTTTATGGAGGGTTCTC |
3.3塔克我消化
虽然我们更喜欢使用塔克对于DNA消化和突变检测，也可以探索其他限制性内切酶，并且可能同样有效。使用不同的酶可以获得关于不同遗传背景下基因座之间突变率差异的有价值信息。然而，RMC分析的效率几乎完全取决于所选限制性内切酶对线粒体基因组的完全消化。因此，并不是每种酶都适合这类应用，并且只应使用高度鲁棒的限制性酶。
塔克我被我们实验室选中有四个原因。首先，塔克我已经被证明是一种非常强健的酶，不受几种DNA损伤的影响，包括DNA乙基化(7)和氧化作用(6). 第二，限制地点塔克I（TCGA）包含所有碱基对，允许对每个核苷酸进行突变筛选。第三，塔克I是一种耐热酶，来源于与塔克聚合酶，实时PCR反应中最常见的酶。这种一致性允许有限的塔克我在PCR反应期间继续消化，这有助于消化PCR扩增期间残留的WT DNA拷贝。第四，塔克我可以从NEB购买1x（cat.#RO149L）或5x浓度（cat.#RO149M）。较高浓度的塔克由于甘油含量高，我在消化过程中被用来抑制淀粉活性。
DNA消化在100μl反应中进行，其中包含100个单位的Taq公司一、 100mM NaCl、10mM Tris-HCl、1×BSA和10mM MgCl2。该缓冲液在25°C时的pH值应为8.4，以补偿在65°C下长时间培养期间pH值的下降，65°C是塔克我消化。添加100个单位塔克我每小时补充一次反应混合物，以补充因长时间培养而失去活性的任何酶。未完全消化塔克我将对不含突变的DNA分子进行PCR扩增塔克我限制网站。因此，应特别注意确保DNA消化完成。每次添加后，彻底混合反应缓冲液的内容物Taq公司我酶解，并确保从管盖上清除冷凝液。随后的步骤包括对单个DNA分子进行PCR扩增，这些实验很容易被微量的气载DNA污染。因此，为了避免样品或其他试剂之间的DNA交叉污染，所有试管在打开之前都应旋转，并且应避免使用水浴进行培养。
虽然TaqI是一种非常强健的限制性内切酶，但我们发现塔克我的网站无法完全消化。我们怀疑，对消化的抵抗是线粒体DNA中存在的异常结构或碱基对的结果。例如，TaqI更喜欢消化双链DNA。因此，包含三股结构的D-loop无法完全消化。DNA复制也可以通过产生单链结构和核糖取代的中间体来干扰TaqI的消化。因此，即使使用TaqI延长孵育期后，仍会出现一些残留的WT DNA，PCR产物应始终使用塔克并通过凝胶电泳进行分析，以确认存在线粒体DNA突变。
3.4 qPCR扩增
要计算样本的突变频率，只需要两个数据点：样本中存在的分子总数和突变的分子数。为了确定这些数量，RMC分析使用了两对引物。一对引物位于a两侧塔克I限制位点，用于量化含有突变的DNA分子。第二对引物不会侧翼a塔克I限制位点，并量化样本中存在的每个mtDNA分子。这两个引物对可以一起用于计算突变频率。
这些引物的设计应该仔细考虑，PCR条件应该在实验开始前进行广泛优化。理想情况下，两个引物的长度约为20个碱基对，退火温度为60°C。为了确保它们在退火温度和放大曲线方面以几乎相同的方式工作，几个在线程序可以帮助设计，包括Invitrogen的Vector NTI软件(www.invitrogen.com/Applications/Cloning/Vector-Design-Software/Vector-NTI-Software.html)，底漆3(http://primer3.sourceforge.net)和不太复杂的程序，如Operon Oligo设计工具包(https://www.operon.com/oligos/toolkit.php). 放大器的最大长度不得超过350个碱基对，最小长度不得超过150个碱基配对。
由于单个DNA分子将被扩增用于突变检测，因此将DNA污染降至最低非常重要。因此，试剂应广泛校准并在使用后丢弃。PCR实验应使用一套专用移液器，并每三个月校准一次。吸管时始终使用屏障尖端，处理含有DNA制剂的试管时应更换手套。移液步骤应保持在最低限度，为了减少样品之间的差异，移液体积不应低于5μl。理想情况下，PCR反应是在PCR罩中进行的，远离运行凝胶的常规工作台，预计会受到DNA污染。然而，无论采取何种预防措施，引物、水或PCR试剂的污染总是可能发生的，最显著的是先前PCR反应中的目标分子被扩增成万亿拷贝。因此，为了进一步避免DNA污染，我们建议使用含有dUTP的实时PCR试剂代替dTTP（Stratagene，SYBR Green Brilliant Mastermix，cat.#600548和#929548）。使用这些试剂将确保所有PCR产物都含有dUMP，而不是dTMP，这将最小化PCR产物污染未来实验的威胁，因为所有PCR反应都可以用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）预先培养，以破坏含有dUMP-的模板。
PCR扩增在25μl反应中进行，包含12.5μl 2x SYBR Green Brilliant Mastermix、0.2μl UDG（NEB，cat.#0280S）、2μl 10pM/μl正向和反向引物以及3.3μl H2O.以下是我们通常使用的PCR程序：
上述协议仅包含标准实时PCR程序不常见的一个步骤，即37°C孵育期，允许UDG销毁污染的PCR产物。此外，我们希望分配给DNA熔化、引物退火和引物延伸的时间比250bp产品所需的时间长得多，以便在每个周期内扩增每个DNA模板。这减少了样品之间的差异，并增加了SYBR green的PCR产物的产量，SYBR green是一种有效的PCR扩增抑制剂。我们更喜欢45个周期的DNA扩增，因为单个DNA分子在周期34左右可以检测到。
3.4.2初步PCR实验
由于突变分子的扩增发生在单分子水平，需要进行初步实验来量化这些分子。然后利用这一知识来确定单分子的稀释度。在最后的实验中，96-well板的每个孔中平均应存在0.2个分子。这种稀释确保只有1/10孔含有突变DNA的单一可扩增拷贝，只有1/400孔含有2个分子。量化DNA拷贝数可以通过对mtDNA进行逐步终点稀释，然后使用扩增突变DNA分子的引物对每个步骤进行PCR扩增来完成。这将提供样本中突变分子数量的近似值。后续实验通过在30个单独的反应中放大≈0.5个分子来确定准确的拷贝数。然后可以根据以下公式计算分子的绝对数量：
其中p（0）是不包含可扩增DNA分子的反应分数。例如，如果1/100稀释在30个反应中产生10个PCR产物，那么每个孔含有−ln 0.666=0.4个突变mtDNA拷贝。通过考虑稀释因子，可以计算出源材料中存在的分子量。同样的程序也可以用于测量带有第二组引物的样品中mtDNA分子的总数。
3.4.3板材设置
在中给出的示例中初步实验确定，每0.2份突变DNA中存在10000份WT-mtDNA。因此，将10000份拷贝分配到B-H行的每个孔中，以便在整个平板中筛查840000份mtDNA的突变。A行用于控制PCR效率和mtDNA拷贝数。为了控制PCR效率，逐步稀释mtDNA，直到达到单分子水平。DNA线性稀释应导致C（t）值线性增加，即DNA扩增超过检测阈值的循环数。为了控制mtDNA拷贝数，将认为存在于A5-A11孔上1拷贝的mtDNA稀释液等分。如果DNA拷贝数计算正确，则几个孔应包含PCR产物，而几个孔不应包含PCR产品。PCR产物应在适当的C（t）值处超过检测阈值。A12井可用作阴性对照。
3.4.4突变验证
DNA模板的适当稀释将导致对塔克我分裂。为了验证这些分子中是否存在DNA突变，对每个PCR产物进行测序。尽管PCR产物中存在dUMP与高质量测序兼容，但PCR反应中尿嘧啶DNA糖基化酶的残余活性最终会破坏PCR产物。因此，为了改进测序结果，建议在每次实验完成后立即将PCR反应保存在-20°C。PCR产物可在测序前通过标准柱（Qiagen，Qiaquick PCR纯化试剂盒，#28104）进行纯化。作为测序的替代方法，用塔克I限制性内切酶可用于验证是否存在突变。由于大多数实时PCR缓冲液使用塔克-聚合酶作为复制酶，1μl/1x塔克我可以直接添加到10μl的25μl PCR反应中，并在65°C下培养10分钟，然后在凝胶上按大小分解反应。
4.MtDNA缺失
虽然通过RMC分析发现的大多数突变都是单碱基对替换，但任何类型的突变都会破坏塔克可以检测到I限制站点，包括插入和删除。然而，由于点突变影响塔克与其他类型的突变相比，I位点更频繁，很少检测到线粒体DNA缺失等复杂重排。然而，通过重新定位引物，RMC分析的检测流行率可以从点突变向DNA缺失倾斜。
关键是多个侧翼塔克我用一对引物定位。对于在这些条件下形成的PCR产品塔克I位点需要在单个mtDNA分子上同时突变。当多次发生时，此类事件发生的频率变得越来越小塔克I站点位于侧面。例如，如果塔克I限制位点突变频率≈1×10-5，2个位点将以（1×10）的频率发生突变-5)2类似地，三个位点将以（1×10-5）的频率突变三等等。因此，通过增加引物对侧翼的限制性位点的数量，由于个体点突变，获得PCR产物的可能性越来越小。相反，您会将检测流行率偏向于消除所有突变事件塔克我同时定位，例如DNA缺失。为了测量这些删除的频率，可以遵循第3节中描述的相同程序。
本试验设计的最重要方面是引物。在引物的退火位点和塔克I限制站点。距离越小，删除塔克I限制性位点也将保持引物着陆位点的完整性。另一方面，该缓冲区也不能太大，因为实时PCR的效率随着扩增子大小的增加而降低。因此，需要达到一个很好的平衡，我们建议您的正向和反向引物距离最近的引物不超过400个碱基对塔克I限制站点。这将防止PCR产物超过最大800个碱基。
引物和塔克我限制网站对解释您的数据有重要影响。例如，因为您允许的引物和塔克I限制位点与你能检测到的线粒体DNA缺失量直接相关，你得到的缺失频率只能用相同的引物和相同的PCR条件进行复制。这使得很难将你的发现推断到基因组中的其他区域。
同样重要的是要意识到你正在筛选基因组中非常有限的一部分。通过将正向引物400个碱基对定位在距离最近的塔克我限制站点，您将屏幕限制为1/40第个线粒体基因组。最有可能的是，有许多删除操作会删除所有塔克我限制分离引物的站点，但是，只有那些在正向引物附近有断点的删除才会被检测到。在那些满足此条件的删除中，您将只检测到在反向引物附近包含第二个断点的删除。因此，实际上，您只会检测到影响塔克I限制站点。总之，这些考虑限制了您概括结果的程度。在我们看来，RMC分析是测量mtDNA缺失的一个很好的工具。它提供了关于任何给定位点的缺失负担的精确信息，使得很容易确定基因型、治疗或年龄导致的缺失率的相对变化。此外，线粒体DNA缺失可以在基因组中的任何位置进行测量，检测到的缺失大小可以通过侧翼调整塔克距离较近或较远的站点。然而，就其性质而言，这是一种给出相对值的分析，重要的是要认识到，它不能用于提供整个线粒体基因组总缺失率的绝对数字。要做到这一点，其他方法更合适，例如本期其他地方描述的单分子分析(20). 这种方法在单细胞分析中特别有用。
5.闭幕词
RMC分析有几个优点，使其成为突变检测的理想方法。也许这种分析最重要的优点是它的敏感性。在10个突变中可以检测到一个突变9WT底座(7). 此外，该检测可应用于任何年龄段的任何组织、任何生物体，这使得它成为解决年龄、环境或转基因结构对线粒体突变作用的理想检测方法。最后，该方法非常具有成本效益，尤其是与大规模测序工作相比。该检测的一个缺点是，对突变进行评分的目标塔克我限制网站，长度为4个基点。因此，一个限制位点的突变频率可能无法准确预测基因组中其他地方的突变率。因此，应始终并行调查多个现场。然而，只要在不同年龄或基因型之间比较相同的限制位点，就可以获得突变率相对增加或减少的明确证据。
通过用引物对侧翼多个TaqI限制位点，RMC分析的检测流行率可以从点突变向DNA缺失倾斜在本例中，使用两对引物通过RMC分析检测mtDNA突变。在A组中，mtDNA突变是用侧翼单个TaqI限制位点（红框）的引物（红色箭头）检测的。从该反应中恢复的大多数突变是单碱基缺失，发生频率为1×10-5缺失也存在，但很少检测到，因为它们的普遍性比mtDNA点突变低25倍。在面板B中，尝试了类似的反应。然而，这一次，突变是用侧翼3的引物对进行评分的塔克I限制站点。因此，由于线粒体DNA点突变，PCR产物的预期频率指数下降到1×10-15相反，mtDNA缺失的发生率要高得多，因此，用这些引物对检测到的每一个突变都是缺失。
脚注
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1Bender A等人。自然遗传学。2006年5月；38:515.[公共医学][谷歌学者] 2Kraytsberg Y等人。自然遗传学。2006年5月；38:518.[公共医学][谷歌学者] 三。Wanagat J、Cao Z、Pathare P、Aiken JM。法赛布·J。2001年2月；15:322.[公共医学][谷歌学者] 4Ishikawa K等人。科学。2008年5月2日；320:661.[公共医学][谷歌学者] 5Vermulst M等人。自然遗传学。2008年3月2日； [谷歌学者] 6Vermulst M等人。自然遗传学。2007年4月；39:540.[公共医学][谷歌学者] 7Bielas JH，Loeb LA公司。自然方法。2005年4月；2:285.[公共医学][谷歌学者] 9Parsons BL、Heflich RH。突变研究。1997年10月；387:97.[公共医学][谷歌学者] 10Dean SW等人。突变。1999年1月；14:141.[公共医学][谷歌学者] 11Weinstock DM、Richardson CA、Elliott B、Jasin M。DNA修复（Amst）2006年9月8日；5:1065.[公共医学][谷歌学者] 12Garcia AM等人。方法分子生物学。2007;371:267.[公共医学][谷歌学者] 16Lin MT、Simon DK、Ahn CH、Kim LM、Beal MF。人类分子遗传学。2002年1月15日；11:133.[公共医学][谷歌学者] 18张德等。基因组学。2000年10月15日；69:151.[公共医学][谷歌学者] 19Kraytsberg Y，Khrapko K。专家修订版分子诊断。2005年9月；5:809.[公共医学][谷歌学者] 20K Y、M P、N A、Khrapko K。方法。2008 [谷歌学者] 21Fernandez Vizarra E、Lopez Perez MJ、Enriquez JA。方法。2002年4月；26:292.[公共医学][谷歌学者] 22Ausubel F等人，In：分子生物学的当前协议。Chanda VB，编辑。第1卷John Wiley&Sons；2002[谷歌学者] 
