MicroRNA-21调控人肝癌PTEN抑癌基因的表达

转染

使用Nucleofector系统（德国科隆Amaxa Biosystems）通过核转染进行转染。首先优化每种HCC细胞类型的转染条件，使用溶液V，程序H22，转染效率为20%-30%，细胞存活率超过80%。购买后10代内，所用正常人肝细胞的转染效率为10.4%±1.0%。单元格（1-2×10⁶)100人被停职μL Nucleofector溶液（Amaxa Biosystems）含有33μ100 nmol/L的miRNA前体、反义miRNA抑制剂、磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）小干扰RNA（siRNA）或之前描述的室温下的相应对照物。¹⁰在研究之前，将转染细胞重新悬浮在含有10%血清的培养基中72小时。除非另有规定，否则所有研究均一式四份。

微小RNA的分离

使用Totally RNA分离试剂盒（德克萨斯州奥斯汀Ambion）从细胞系和组织样品中获得总RNA。如前所述，使用flashPAGE分馏器系统（Ambion）通过flashPACE纯化获得miRNA部分。¹⁰使用安捷伦2100生物分析仪（安捷伦科技公司，加利福尼亚州帕洛阿尔托）确认miRNA组分的大小。

MiRNA阵列杂交与分析

如前所述，使用mirVana miRNA阵列标记试剂盒（Ambion）和标记后活性染料试剂盒（宾夕法尼亚州匹兹堡Amersham Bioscience）用Cy3（对照样品）或Cy5（处理样品）标记分离的miRNAs的3′末端。¹⁰使用miRNA清洗缓冲液清洗标记样品3次，在同一个标记盒中混合，洗脱并储存在−70°C下，或通过与miRNA阵列杂交进行分析。使用mirVana miRNA阵列探针集（Ambion）和OmniGrid微阵列仪（Gene Machines，加州圣卡洛斯）在玻璃载玻片上生成miRNA阵列。每个探针打印两份。杂交后，使用GenePix 4000A阵列扫描仪（Axon Instruments，Union City，CA）扫描miRNA阵列。使用GeneSpring 7.0软件（Silicon Genetics，加利福尼亚州红木市）对原始数据进行标准化和分析。通过表达每个miRNA复制品相对于添加到每个样品中的对照miRNA（Ambion）进行标准化，从而允许在芯片之间进行比较。生成了4组每个重复的平均强度值。使用基因组研究所（马里兰州罗克维尔）的MultiExperimenta Viewer软件进行聚类分析。¹¹详细信息和实验数据已存储在ArrayExpress数据库中(网址：www.ebi.ac.uk/arrayexpress)注册号为E-MEXP-1125。

成熟miRNA的实时聚合酶链反应检测

如前所述分离microRNA，并使用TaqMan人类microRNA检测试剂盒（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）通过实时聚合酶链反应（PCR）分析确认特定成熟microRNA的表达。

Northern Blot分析

一份等分（10–20μg） 总RNA的%进行变性（7 mol/L尿素）聚丙烯酰胺（15%丙烯酰胺）凝胶电泳，转移到Zetaprobe GT膜（Bio-Rad，Hercules，CA），通过紫外线交联固定到膜上，并在42°C下杂交过夜³²如前所述，P标记的mir-21反义脱氧寡核苷酸。⁸用5S核糖体RNA的反义寡核苷酸对印迹进行重复，以显示每个通道中的RNA负载量。对印迹进行放射自显影，并使用柯达成像软件（纽约州罗切斯特）定量miR-21与5S核糖体RNA的比率。

PTEN和基质金属蛋白酶的实时PCR分析

使用RNA分离试剂盒（Bio-Rad）分离RNA，并使用1μg总RNA和逆转录试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA）。如前所述，在MX 3000P PCR仪器（加州圣地亚哥斯特拉赫尼）上进行实时定量PCR，并使用SYBR Green作为检测荧光团。¹²使用的正向（F）和反向（R）引物如下：基质金属蛋白酶（MMP）-1-F 5′-AGCTAGCTCAGGACATTGATG-3′，MMP-1-R 5′-GCCGATGGACAG-3′；MMP-2-F 5′-TGGCGATGGATCCATCT-3′，MMP-2-R 5′-TTCTCCAAGGTCATCAT-3′；MMP-3-F 5′-TGG CATTCTCCCTCTATGG-3′，MMP-3-R 5′-AGGACAGAGAGATCAGTT-3′；MMP-9-F 5′-ctcgggcagattccaaacct-3′，MMP-9-R 5′-gcaagtccgagtttgga T-3′；MMP-11-F 5′-TGACTTCTTTGGCTGTGCC-3′，MMP-11-R 5′-GTTTCATGGTTGTACC-3′；β-肌动蛋白-F 5′-CCAAGGCCAACCG AGAGATGAC-3′，和β-肌动蛋白R:5′-AGGTACATGGTGCCGCCAGAC-3′。PCR参数如下：95℃下10分钟，然后在95℃下40个周期，30秒，60℃下1分钟。每个样品测试三次。确定每个样品/引物对的阈值，并计算平均误差值和标准误差值。PCR产物通过熔融曲线分析以及PCR产物的1.8%琼脂糖凝胶电泳进行验证。mRNA水平β-肌动蛋白被用作内部对照，基因特异性mRNA表达根据β-肌动蛋白表达。对于PTEN，使用5′-CGGCAGCATCAAATGTTCAG-3′和5′-AACTGGCAGTAGAGCAACTC-3′以及55°C退火温度进行实时PCR。

细胞增殖试验

使用CellTiter 96 AQueuous分析试剂盒（威斯康星州麦迪逊市Promega）评估细胞增殖。转染后，将细胞（10000个/孔）置于96个平板（BD Biosciences，Rockville，MD）中，并在37°C下培养，如前所述，72小时后评估细胞增殖。¹³

细胞运动性测定

正常人肝细胞、SK-HEP-1细胞和SNU-182细胞（5×10⁴细胞）放置在BD Falcon HTS FluoroBlok插入物的顶部腔室中，该插入物带有一层含有8-μ300个孔中有m个孔（BD Biosciences）μL无血清Dulbecco改良Eagle培养基一式三份。插入物被放置在96周板的底部腔室中，该板含有Dulbecco改良的Eagle培养基和作为化学引诱剂的胎牛血清（5%）。通过膜孔迁移到底室的细胞被标记为8μg/mL calcein-AM（分子探针，尤金，OR）在37°C的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中放置30分钟。用荧光计在485 nm激发波长和530 nm发射波长下量化迁移细胞的荧光，并用任意荧光单位表示。数据表示为4次单独测定的平均值±标准误差。

侵入性分析

使用QCM 96-well细胞侵袭检测试剂盒（Chemicon International，Temecula，CA）通过从Engelbreth Holm-Swarm小鼠肿瘤制备的基底膜蛋白固体凝胶评估细胞侵袭。

西方印迹法

在100 mm培养皿中生长的细胞在溶解前用冰镇PBS清洗两次，方法是在1 mL冰镇细胞溶解缓冲液中培养20分钟（1%Nonide P-40，50 mmol/L HEPES，pH 7.4，150 mmol/L.NaCl，2 mmol/L-乙二胺四乙酸，2 mmol/L苯甲基磺酰基氟化物，1 mmol/L.钒酸钠，1 mmol/L:氟化钠和1×蛋白酶抑制剂混合物）。将改良的细胞裂解缓冲液（不含磷酸酶抑制剂钒酸钠和氟化钠）用于局灶性黏着激酶（FAK）[对-Tyr^516/517]仅免疫印迹。使用Bradford蛋白质测定试剂盒（Bio-Rad）测量裂解物的蛋白质浓度。将等量的蛋白质与6×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳样品缓冲液混合，在4%–20%线性梯度Tris-HCl-ready凝胶（Bio-Rad）中电泳，然后转移到硝化纤维素膜。按照制造商的说明，用5%脱脂干乳在pH 7.4的Tris缓冲盐水（含0.05%吐温20）中封闭膜，并用一级抗体以及IRDye700和IRDye800标记的二级抗体（宾夕法尼亚州吉尔伯茨维尔罗克兰）进行培养。使用LI-COR Odyssey红外成像系统（LI-COR Bioscience，Lincoln，NE）对感兴趣的蛋白质进行可视化和定量。

免疫细胞化学

细胞在1.5%明胶涂层培养箱中培养汇合（Chemicon International）。单层被洗涤两次，并在100%冰镇丙酮中固定10分钟，然后在含有2%兔血清和5%鼠血清的PBS中在室温下封闭1小时，然后与初级抗体、鼠抗PTEN（1:100）和兔抗P-FAK（1:100在4°C下过夜，然后在室温下用异硫氰酸仲荧光素缀合的抗兔（1:200）和德克萨斯红缀合的抗小鼠IgG（1:200）孵育1小时。经过3次洗涤后，使用带有DAPI（分子探针）的ProLong防褪色安装介质将单层膜安装在玻璃载玻片上。使用Carl Zeiss MicroImaging Inc.（纽约州桑伍德）的Axiovert 200电动荧光显微镜成像系统查看和捕获图像。

荧光素酶报告分析

pGL3-PTEN-3′-UTR构建物如报告所示，包含pGL3萤火虫荧光素酶报告子中终止密码子下游mir-21的假定结合位点。¹⁰将SK-HEP-1和SNU-182细胞（2×10⁶细胞/孔）。1微克pGL3-PTEN-3′-UTR构建物与1μg Renilla荧光素酶表达构建pRL-TK（Promega），使用Trans-It（Mirus，Madison，WI）。转染48小时后，使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）进行荧光素素酶分析。萤火虫荧光素酶活性归一化为每个样本的肾小球荧光素酶表达。

试剂

miR-21、miR-132的前miR miRNA前体和抗miR miRNA-特异性抑制剂，以及对照前体和抑制剂miRNA均购自Ambion。从圣克鲁斯生物技术公司（加州圣克鲁斯）获得了过氧化物酶偶联的抗兔和抗鼠二级抗体。抗PTEN和磷酸化-FAK的抗体^516/517]来自圣克鲁斯生物技术公司。；phospho-Akt[血清⁴⁷³]来自Cell Signaling Inc.（马萨诸塞州贝弗利）；和α-来自Sigma（密苏里州圣路易斯）的微管蛋白。PTEN和对照siRNA来自细胞信号转导。

miRNAs在人类恶性肝细胞中的表达不同

分析整个肿瘤中miRNA表达的研究可能会因存在非恶性肝细胞的细胞类型而受到干扰。事实上，胆道上皮中的miRNA表达与肝细胞中的不同。¹⁰为了研究异常miRNA在肝癌病理生理过程中的潜在作用，我们首先分析了正常组织、肿瘤组织和几个肝癌细胞系中miRNA的表达(补充图1；补充材料在线，网址：网址：www.gastrojournal.org). 在每种细胞类型中，miRNA的表达范围很广，从无法检测到到相对于内部标准对照的24倍以上。值得注意的是，不同细胞类型的表达模式不同。归一化后，与内部对照miRNA的表达相比，在体外和体内可以看到一些miRNA的增加表达。这些miRNA包括miR-21、let7a-1、let7c、let7d、let7f、miR-16-1、miR-17-5p、miR-23、miR-24和miR-320。在所有细胞系和肿瘤组织中，miR-21和let-7家族的选定成员的表达增加了5倍以上，而let-7b、miR-127、miR-149、miR-154、miR221和miR-329的表达减少。由于miRNA的表达模式可能以组织特异性的方式发生，这些特异性miRNA可能反映了肝谱系的标记。miR-122在肝脏组织中含量丰富且具有特异性，在SK-HEP-1、SNU-182和SNU-449细胞中显著降低，但在HepG2和PLC/PRF-5中没有降低。事实上，SK-HEP-1、SNU-182和SNU-449细胞的表达模式彼此相似，与HEP-G2和PLC/PRF-5细胞不同。这些差异可能反映了这些细胞系发育起源的差异。

接下来，我们比较了恶性和非恶性肝细胞的miRNA表达，并用体内发现的模式进行了确认。miRNA在恶性细胞中的表达模式与正常人肝细胞明显不同。在恶性细胞中，与非恶性细胞相比，大多数miRNAs的表达降低。我们测定了197个miRNA中所有miRNA的百分比，与对照标准miRNA的表达相比增加了2倍以上。正常肝细胞中25.6%的miRNA表达增加，高于Hep-G2（18.8%）、SK-Hep-1（12.2%）、SNU-182（9.8%）、SNU 449（10.3%）、，或PLC/PRF-5（10.9%）电池。这些数据与我们的体内研究结果相似，我们的体内结果显示，正常肝组织中的miRNAs表达增加了23.8%，但在HCC组织中只有12.4%。与正常人肝细胞相比，在至少4个肝癌细胞系中，包括人类miR-21、miR-34a和miR-20在内的一组miRNA的表达增加了2倍以上(表2). 这些miRNAs可能在恶性转化或肿瘤细胞行为中发挥重要作用。

miR-21在原发性人类肝癌中上调

之所以选择miR-21进行进一步研究，是因为在我们对HCC细胞系的分析研究中，它是最过表达的miRNA，此外，在喂食叶酸/甲基缺乏饮食的大鼠诱导的肝肿瘤中，它的表达增加。⁸此外，miR-21在其他几种癌症中过度表达。^10,14,15为了确定miR-21在原发性人类肝癌中是否上调，使用总RNA和³²P标记的脱氧寡核苷酸对mir-21不敏感。结果表明，在所分析的20份HCC样本中，与匹配的非肿瘤肝组织相比，14份样本（样本1、5、9和10-20）的miR-21显著上调2倍或更多（2-65倍）(图2). 这些结果表明，miR-21在人类原发性肝癌中的表达确实频繁增加。

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图2

miR-21在人类原发性肝癌中上调。从HCC（T）和匹配对照（N）中分离出总RNA，并按照材料和方法部分所述进行Northern blot分析。通过柯达成像软件对每条车道上的信号进行量化，并测定miR-21与5S核糖体RNA的比值。星号表示mir-21上调的人类原发性肝癌。在前9个样本中，由于更多的RNA（20μg） 已加载。对于样品10–20、10μ加载了g RNA。

miR-21调节细胞增殖

为了研究miR-21在肝癌中的病理生理作用，我们首先通过实时PCR分析成熟miR-21的表达，验证了miR-21是否在肝癌细胞系中表达。这些发现与使用miRNA微阵列观察到的表达模式相似(图3). 为了表征miR-21对细胞增殖的影响，我们使用miR-21前体进行了过度表达研究，并使用miR-21-特异性反义寡核苷酸抑制剂（抗miR-21）进行了抑制研究。在HepG2、PLC/PRF-5、SK-HEP-1和SNU-182细胞系中，抗miR-21可降低细胞增殖(图4A). 相反，抗miR-132并未显著改变细胞增殖（数据未显示），其在恶性肝细胞中的表达没有改变。此外，转染miR-21前体的细胞增殖增加(图4B). 这些研究表明，miR-21的表达可以调节肿瘤细胞的生长。

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图3

肝癌细胞系中miR-21的表达增加。从正常人肝细胞和5个肝癌细胞系中分离出miRNA。(A类)用miRNA微阵列标记和分析miRNA。miR-21的代表性杂交点如左图所示，而来自4个独立研究的定量表达数据如右图所示。(B类)使用TaqMan microRNA检测试剂盒对miR-21进行实时定量PCR。代表性放大图和分离曲线显示在左侧，而代表三次实验平均值和SD的定量数据显示在右侧的条形图中。miR-21的表达被标准化为U6B小核RNA基因（RNU6B）对照的表达*P（P）与正常肝细胞中的表达相比，<0.05。

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图4

miR-21对细胞增殖和迁移的调节。(A类)用30 nmol/L miR-21特异性抑制剂（■）或对照miRNA抑制剂（□）转染肝癌细胞，72小时后评估增殖指数。(B类)用30nmol/L的miR-21前体（灰色条）或对照miRNA前体（□）转染HCC细胞，并在72小时后评估增殖指数。(C类)用抗miR-21（■）或对照抑制剂（□）转染HCC细胞-μm孔按照材料和方法一节中的描述进行评估，并表示为任意荧光单位（AFU）。(D类)通过实时PCR检测转染对照组或miR-21前体的正常人肝细胞（HHC），或转染对照或抗miR-21抑制剂的HepG2细胞中miR-21的表达。(E类)用mir-21前体（灰条）或对照miRNA前体（□）转染正常人肝细胞，并评估细胞迁移。对4个独立实验的平均误差和标准误差进行了说明*P（P）与对照组相比，<0.05。

miR-21调节细胞迁移和侵袭

我们评估了miR-21在细胞迁移（恶性进展和转移的关键决定因素）中的作用。用对照前体或抑制剂转染肝癌细胞系或正常肝细胞，并评估垂直迁移。抗miR-21和对照抑制基因转染的HCC细胞在细胞迁移方面存在显著差异(图4C). 此外，与转染对照组的细胞相比，转染前体miR-21的正常人肝细胞的细胞迁移增加(P（P）= .011) (图4E). 然而，用前体miR-132转染正常人肝细胞并没有显著改变细胞迁移(P（P）=.48），或抗miR-132的SNU-182细胞(P（P）= .37). 接下来，我们测定了miR-21对细胞侵袭细胞外基质的影响。肝癌细胞系的侵袭潜能不同，SK-HEP-1、SNU-182和HEP-G2具有最大的侵袭活性(图5A). 用对照或miR-21特异性抑制剂转染四种肝癌细胞株，72小时后评估其侵袭潜能。我们发现抗miR-21使所有细胞系的侵袭指数降低了35%–41%(图5B)而抗miR-132未能显示出显著效果（数据未显示）。这些结果支持miR-21在介导恶性肝细胞的细胞增殖、迁移和侵袭中的功能作用，并提示miR-21的过度表达可能有助于人类肝癌的肿瘤转移。

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图5

miR-21对细胞侵袭的调节。(A类)正常人肝细胞（HEP）或HCC细胞（5×10⁴)接种在96个预先涂有细胞外基质的平板中，并按照材料和方法一节中的描述评估细胞侵袭。入侵指数表示为任意荧光单位（AFU）。细胞系侵袭细胞外基质的能力不同(B类)用30 nmol/L抗miR-21（■）或对照抑制剂（□）转染肝癌细胞，72小时后评估细胞侵袭性。抗miR-21可降低所有4种细胞系的细胞侵袭性。所示结果代表4个独立实验的平均±标准误差*P（P）与对照组相比，<0.05。

PTEN是miR-21的潜在靶点

我们之前使用生物信息学方法确定了蛋白酪氨酸磷酸酶PTEN作为miR-21的潜在靶点。¹⁰为了评估miR-21是否能直接改变肝癌细胞中PTEN的表达，将PTEN mRNA的3′-UTR片段（包含假定的miR-21结合序列）克隆到萤火虫荧光素酶报告基因构建物中，并与对照肾素荧光素素酶报告子构建物共转染到SK-HEP-1、SNU-182、HepG2、，或PLC/PRF-5细胞以及对照或miR-21特异性抑制剂。在所有肝癌细胞中，抗miR-21的相对荧光素酶活性增加，表明miR-21可以直接调节PTEN 3′-UTR的基因表达(图6).

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图6

PTEN是miR-21的靶点。HCC细胞被放置在6孔板中。细胞转染1μ肾素荧光素酶表达结构pRL-TK和1的gμg的pGL3-PTEN-3′-UTR萤火虫荧光素酶表达结构，以及抗miR-21或对照抑制剂。在存在抗miR-21的情况下，萤火虫荧光素酶相对活性的增加表明PTEN的3′-UTR包含一个受miR-21调控的靶点。数据表示8次单独测定的平均值±标准误差*P（P）与对照组相比，<0.05。

miR-21同时调节PTEN表达和FAK磷酸化

PTEN公司是一种肿瘤抑制基因，其在肿瘤生物学中的作用具有很好的特征。¹⁶我们评估了PTEN在人肝癌肿瘤、正常人肝细胞和几个肝癌细胞系中的细胞表达。首先，我们通过免疫组织化学方法评估了4例人肝癌肿瘤样本中PTEN蛋白的表达，但使用2种不同的抗体无法检测到任何表达。接下来，我们通过实时PCR检测了11例肝癌肿瘤和非肿瘤样本中的PTEN mRNA(图7A). 在部分但并非所有HCC样本中，miR-21表达和PTEN mRNA表达呈负相关。通过免疫印迹分析，与正常肝细胞相比，所有恶性细胞系中PTEN的表达均降低(图7B). 此外，作为PTEN下游靶点的FAK的构成性酪氨酸磷酸化增加^17,18FAK是一种蛋白酪氨酸激酶，参与调节细胞周期进展、细胞存活和细胞迁移。PTEN的表达导致FAK去磷酸化并抑制细胞迁移。接下来我们评估了miR-21对PTEN表达和FAK酪氨酸磷酸化的作用。用miR-21前体转染正常人肝细胞降低PTEN蛋白表达并诱导Tyr516/517处FAK的酪氨酸磷酸化(图7C). 此外，肝癌细胞系中miR-21的抑制显著降低了FAK和Akt的磷酸化，这两个PTEN的下游靶点是肿瘤细胞生存和侵袭的关键介质(图7D).

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图7

miR-21调节PTEN和下游激酶的表达。(A类)在11例HCC肿瘤（灰条）和匹配的非肿瘤切片（□）中获得的RNA中评估PTEN表达的实时PCR。PTEN表达标准化比率显示在每个条的上方。(B类)细胞裂解物取自在100 mm培养皿中培养的正常人肝细胞和HCC细胞系。使用磷酸化状态依赖性抗体对PTEN和FAK激活进行免疫印迹分析。污渍被剥离并重新处理α-微管蛋白作为负荷控制和定量。代表性免疫印迹与定量数据一起显示了4个单独印迹的平均±标准误差*P（P）相对于正常肝细胞中的表达，<.05。(C类)用30 nmol/L miR-21前体或对照转染正常人肝细胞。72小时后进行PTEN和磷酸化FAK的免疫细胞化学。与对照组相比，转染miR-21前体的细胞中PTEN表达减少，FAK磷酸化增加。(D类)用30 nmol/L抗miR-21或对照抑制剂转染肝癌细胞。72小时后获得细胞裂解物，用于PTEN蛋白表达的免疫印迹分析及其下游靶激酶Akt和FAK的磷酸化。显示了4个独立印迹的代表性免疫印迹和定量数据（平均值±标准误差）*P（P）相对于对照组的表达<.05。

PTEN通过FAK去磷酸化抑制几种MMPs的表达。^18,19为了证实PTEN的miR-21依赖性调节的功能相关性，我们评估了参与细胞侵袭的MMPs的表达。用miR-21前体转染正常人肝细胞增加MMP-9 mRNA表达(图8A). 与正常肝组织中的表达相比，HCC肿瘤中MMP-2和MMP-9的表达分别增加21.7±8.7倍和17.5±8.6倍。此外，抗miR-21转染SK-HEP-1、SNU-182和HEP-G2肝癌细胞株后，MMP-2和MMP-9的表达均降低(图8B). 我们的发现为miR-21与肝癌细胞系中细胞侵袭介质的表达之间的联系提供了证据。这些数据表明，miR-21在恶性肝细胞中的表达改变可能通过功能性放松关键信号中间产物的活性而导致转移。

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图8

miR-21调节MMPs的mRNA表达。(A类)用miR-21前体或对照转染正常人肝细胞。对MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-11和β-肌动蛋白mRNA表达。miR-21的增强表达增加了正常人肝细胞中MMP-9 mRNA的表达*P（P）<.05（相对于对照）。(B类)用抗miR-21转染SK-HEP-1、SNU-182和HEP-G2细胞。通过实时PCR评估MMP-2、MMP-9和MMP-11 mRNA的表达，并将其归一化为β-肌动蛋白mRNA。数据总结自一式四份的三个实验。与对照组相比，抑制miR-21降低了肝癌细胞株中MMP-2和MMP-9 mRNA的表达*P（P）<.05（相对于对照）。

由斯科特和怀特医院基金会以及美国国立卫生研究院的DK069370和CA122694拨款支持。