《维罗尔杂志》。2007年1月；81(1): 150–158.
基于新城疫病毒的减毒活疫苗完全保护鸡和小鼠免受同源和异源H5N1禽流感病毒的致命挑战▿
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金鹰阁
中华人民共和国哈尔滨市马端街427号，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，农业部兽医生物技术和动物流感国家重点实验室150001，1佐治亚州亚特兰大市罗林斯研究中心埃默里大学医学院微生物学和免疫学系，邮编303222
邓国华
农业部兽医生物技术和动物流感国家重点实验室，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨市马道街427号，150001，1佐治亚州亚特兰大市罗林斯研究中心埃默里大学医学院微生物学和免疫学系，邮编303222
致远文
农业部兽医生物技术和动物流感国家重点实验室，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨市马道街427号，150001，1佐治亚州亚特兰大市罗林斯研究中心埃默里大学医学院微生物学和免疫学系，邮编303222
田国兵
农业部兽医生物技术和动物流感国家重点实验室，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨市马道街427号，150001，1佐治亚州亚特兰大市罗林斯研究中心埃默里大学医学院微生物学和免疫学系，邮编303222
王勇（音）
农业部兽医生物技术和动物流感国家重点实验室，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨市马道街427号，150001，1佐治亚州亚特兰大市罗林斯研究中心埃默里大学医学院微生物学和免疫学系303222
施建中
农业部兽医生物技术和动物流感国家重点实验室，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨市马道街427号，150001，1佐治亚州亚特兰大市罗林斯研究中心埃默里大学医学院微生物学和免疫学系，邮编303222
王西军（Xijun Wang）
农业部兽医生物技术和动物流感国家重点实验室，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨市马道街427号，150001，1佐治亚州亚特兰大市罗林斯研究中心埃默里大学医学院微生物学和免疫学系，邮编303222
李彦兵
农业部兽医生物技术和动物流感国家重点实验室，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨市马道街427号，150001，1佐治亚州亚特兰大市罗林斯研究中心埃默里大学医学院微生物学和免疫学系，邮编303222
胡森（Sen Hu）
农业部兽医生物技术和动物流感国家重点实验室，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨市马道街427号，150001，1佐治亚州亚特兰大市罗林斯研究中心埃默里大学医学院微生物学和免疫学系，邮编303222
江永平
农业部兽医生物技术和动物流感国家重点实验室，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨市马道街427号，150001，1佐治亚州亚特兰大市罗林斯研究中心埃默里大学医学院微生物学和免疫学系，邮编303222
杨庆来
农业部兽医生物技术和动物流感国家重点实验室，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨市马道街427号，150001，1佐治亚州亚特兰大市罗林斯研究中心埃默里大学医学院微生物学和免疫学系，邮编303222
余康珍
农业部兽医生物技术和动物流感国家重点实验室，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨市马道街427号，150001，1佐治亚州亚特兰大市罗林斯研究中心埃默里大学医学院微生物学和免疫学系，邮编303222
志高卜
农业部兽医生物技术和动物流感国家重点实验室，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨市马道街427号，150001，1佐治亚州亚特兰大市罗林斯研究中心埃默里大学医学院微生物学和免疫学系，邮编303222
陈华兰
农业部兽医生物技术和动物流感国家重点实验室，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨市马道街427号，150001，1佐治亚州亚特兰大市罗林斯研究中心埃默里大学医学院微生物学和免疫学系，邮编303222
农业部兽医生物技术和动物流感国家重点实验室，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨市马道街427号，150001，1佐治亚州亚特兰大市罗林斯研究中心埃默里大学医学院微生物学和免疫学系，邮编303222
*通讯作者。通讯地址：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨市马兜街427号，邮编150001。布志高的电话：86-451-85935062。传真：86-451-82733132。电子邮件：nc.ca.irvh@bgz。陈华兰的电话：86-451-85935079。传真：86-451-82761925。电子邮件：moc.oohay@1nehclh. 收稿日期：2006年7月15日；2006年10月9日接受。
摘要
H5N1高致病性禽流感病毒（HPAIV）继续传播，对动物和人类健康构成严重威胁。目前的流感疫苗策略存在局限性，无法有效用于现场动物的广泛接种。然而，新城疫病毒（NDV）疫苗株已成功用于为大量动物接种疫苗。在本研究中，我们使用反向遗传学构建了一种表达H5亚型禽流感病毒（AIV）血凝素（HA）的NDV。将来自HPAIV野鸟分离物a/Bar-headed goose/3/2005（H5N1）的野生型和突变HA开放阅读框（ORF）插入LaSota NDV疫苗株的P和M基因之间的基因间区域。稳定表达野生型和突变型HA基因的重组病毒经1日龄鸡脑内接种后无毒。在鸡体内单剂量的重组病毒可诱导NDV和AIV H5特异性抗体，并完全保护鸡免受致命剂量的快速NDV和同源及异源H5N1 HPAIV的攻击。此外，用基于NDV的重组疫苗免疫的BALB/c小鼠产生H5 AIV特异性抗体，并完全免受同源和异源致命病毒的攻击。我们的结果表明，重组NDV适合作为家禽NDV和AIV感染的双价减毒活疫苗。重组NDV疫苗也可能用于高危人群，以控制致命禽流感的大流行传播。
H5N1禽流感一直是兽医和公共卫生的一个严重问题。1996年，中国首次检测到H5N1禽流感病毒（AIV）A/Goose/Gendangdong/1/96（GS/GD/96），该病毒是从广东省鹅中分离出来的(5,41). 1997年，H5N1禽流感病毒在香港引起家禽疫情(31,32)并传染给人类，导致6人死亡(8,33). 从2003年末开始，H5N1流感病毒开始在中国传播并导致疾病暴发(39)，日本(21)，韩国(18)、泰国、越南、印度尼西亚、柬埔寨、马来西亚和老挝（国际兽疫局[OIE]；网址：http://www.oie.int)，导致数亿只家禽被毁，其中包括鸡、鸭和鹅。2005年5月，中国西部青海湖野生鸟类中爆发H5N1高致病性禽流感病毒(6,7,20). 此次疫情期间从野生鸟类种群中发现的H5N1病毒基因型之一，即A/Bar-headed goose/青海/3/2005（H5N1）（BHG/QH/05），继续传播到欧洲、非洲、中东和中亚国家（国际兽疫局；网址：http://www.oie.int)导致野生鸟类和家禽患病和死亡。最近，世界上多个国家再次发现人类H5N1感染病例（世界卫生组织；网址：http://www.who.int). H5N1流感病毒对家禽和公共卫生构成的威胁似乎没有减少。
全世界已确认200多例人类AIV感染病例，大多数感染病例是由于直接接触H5N1流感病毒感染的家禽所致。因此，有效控制家禽中的禽流感是公共卫生的一个重要问题。扑杀受感染的家禽是控制或根除高致病性禽流感疫情的古老方法，也是防止传播给人类的最著名方法。然而，当病毒在广阔的地区传播并感染多种禽类时，扑杀和物理遏制不太可能成功。另一种控制策略是使用扑杀加疫苗接种。全病毒灭活疫苗和基于禽痘病毒的重组疫苗已在实验室和位于有限地理区域内的家禽养殖场中用作高致病性禽流感的控制策略(4,10,12,28,29,34,36,37). 然而，这些疫苗的生产成本和实验室管理限制了它们在该领域的广泛应用。
新城疫是由高致病性新城疫病毒（NDV）引起的，属于该属腮腺炎病毒属在家里副粘病毒科它们对家禽业的重要性与禽流感病毒相似。高致病性新城疫病毒感染可能导致全世界许多鸟类100%死亡(2). 目前，世界各地经常使用天然无毒NDV株作为活疫苗(1,2)，并且反向遗传学系统的开发提供了一种生成基于NDV的重组活病毒载体疫苗的方法(22,23,26). 使用无毒NDV株作为疫苗载体有几个优点。它们可以通过饮用水或喷雾进行管理，从而使在田间接种大量动物成为可能。此外，与灭活疫苗相比，NDV疫苗的生产成本更低，产量更高。由于这些优点，以新城疫病毒为靶点的禽流感病毒活疫苗可以在控制动物体内禽流感病毒的感染和传播方面取得成功，因此可以成为控制禽流感病毒向人类传播的有效武器。
在本研究中，我们建立了一个反向遗传学系统，以从H5N1病毒中产生表达AIV血凝素（HA）基因的重组NDV。将BHG/QH/05的H5 HA基因插入LaSota NDV疫苗株。我们确定，我们的基于NDV的重组疫苗具有免疫原性，并且作为H5 AIV-NDV双价疫苗在鸡中有效。我们还发现，我们的基于NDV的重组疫苗在鸡和小鼠中对同源和异源H5N1流感病毒的攻击具有完全保护作用。
材料和方法
病毒和细胞。
HEp-2和BHK-21细胞在含有10%胎牛血清的Eagle最小基本培养基中生长。重组NDV株和野生型NDV株在9天龄、特异无痘（SPF）鸡胚中生长。用作载体的NDV疫苗株LaSota和用于挑战性研究的强毒力NDV株F48E9最初来自中国兽医培养物收藏中心。中国首次分离的H5N1高致病性禽流感高致病性禽流感病毒GS/GD/96和从健康鸭身上分离的A/Duck/FJI/13/02（DK/FJ/02）已被鉴定为先前报道的特征(5,41). 2005年中国西部野生鸟类H5N1禽流感暴发期间，从一只鹅身上分离出BHG/QH/05病毒(6). 这些病毒在10天龄SPF鸡胚卵的尿囊腔中繁殖，并在RNA提取或挑战性研究之前保存在−70°C的冰箱中。表达T7 RNA聚合酶的改良痘苗病毒安卡拉株（MVA）（来自美国国立卫生研究院Bernard Moss的慷慨礼物）(40)在原代鸡胚成纤维细胞中生长。
质粒构建。
以低拷贝数质粒pBR322为骨架构建NDV感染性克隆。我们在pBR322的EcoRI和HindIII位点之间插入了丁型肝炎病毒（HDV）核酶和T7终止子，并将质粒命名为pBRT。
NDV株LaSota在10天龄SPF胚胎卵中生长。使用RNeasy迷你试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚QIAGEN）提取病毒RNA。用病毒特异性引物对提取的RNA进行逆转录（RT）-PCR（表)和高保真度Pfx公司DNA聚合酶（Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA）生成整个病毒基因组的十个重叠PCR片段。将含有T7启动子序列、NDV LaSota基因组全长（15186-nucleotide）cDNA的抗原基因定向cDNA和部分HDV核酶序列的组装cDNA插入pBRT的SalI和BsrII位点之间，得到的质粒命名为pLa。从pLa中扩增NP、P和L基因的开放阅读框（ORF），构建NP、P和L表达质粒。将扩增的NP、P和L基因分别插入质粒pBluescript（Clontech，Mountain View，CA）的SmaI位点，并分别命名为pT7-NP、pT7-P和pT7-L。组装的全长cDNA克隆和编码LaSota NP、P和L蛋白的支持质粒全部测序。
表1。
| 碎片 | 正向底漆 | 反向底漆 |
|---|
| 一层楼 | 5′-CTGAGAGCTCGTCGAC公司GTAATACGACTATA公司GGACCAAACAGAGAATCCGTGAG-3′ | 5′-AGGACTGATGCCATAC公司CCATGG公司 |
| F2频率 | 5′-战术控制CCATGG公司GTATGG公司 | 5′-CTTACTTACTCTGT关贸总协定G公司 |
| 第三层 | 5′-GTCTATGGAGGC公司关贸总协定自动控制 | 5′-GAAGAGGTGCAAA公司AAGCTT公司AG公司 |
| 四层 | 5′-AGAG（5′-AAG）GTGCAC公司GGACTAAGCTTTTG公司 | 5′-标签TCTAGA公司G公司 |
| 五楼 | 5′-GCTGGGAATAATATAC公司坦桑尼亚联合共和国总费用 | 5′-GTACTGCTTGAACTCA公司CTCGAG公司 |
| 功能6 | 5′-GTCGCATA公司CTCGAG公司TGAGTTC公司 | 5′-ATGTACCTGACGG公司CTCGAG公司标签 |
| 第7层 | 5′-TGTCCAGCTA公司CTCGAG公司CCGTCA公司 | 5′-中国民航总局CCCGGG公司TCA公司 |
| 8层 | 5′-GAATATCGGTGA公司CCCGGG公司GACT公司 | 5′-GTTGTCATTGAAAG公司ATCGAT公司TCG公司 |
| 九楼 | 5′-GGTTTATCTCTAATCGAATCGAT公司C类 | 5′-GCTAGTTGATCTAGTAAGCTT公司TG公司 |
| 10层 | 5′-CAGGGTCCAATCA公司AAGCTT公司自动控制 | 5′-AGTCTCTAGA公司卡格特cggaccg公司cgaggagtggagatgcatgccatcgacccACAAAAGATTGGTGAATG-3′b条 |
用5′GACTGTTTAAAC引物对扩增了BHG/QH/05 HA基因ORF的1758个核苷酸的cDNA塔加AAAAAT型ACGGGTAGAA公司加拿大天然气公司GCCACC公司ATGGAGAAAAAGTGCTTCTTC3′和5′GCGCGTAAACTTAATGCAAATTGCATTG3′，其中基因结束和基因开始序列（带下划线）(16)和最佳Kozak序列（斜体）(15). BHG/QH/05的HA基因通过在NDV基因组3165位核苷酸的P-M基因间区引入PmeI位点，被导入pLa中的NDV基因组。合成的质粒命名为pLa-H5w。代表BHG/QH/05突变HA基因的1746个核苷酸的cDNA，在该基因中，切割位点的多个碱性氨基酸被删除(36)也插入pLa的P-M基因间区。合成的质粒命名为pLa-H5m。pLa-H5w和pLa-H5m均保持NDV基因组长度为6的倍数，以实现高效复制。
病毒救援。
为了从质粒中产生病毒，在六孔板中生长的HEp-2细胞以1倍感染率（MOI）感染MVA-T7，然后转染1μg pLa和pLa-H5w或pLa-H5m以及以下表达质粒：0.4μg的pT7-NP，0.2μg的pT7-P，0.2μg.的pT7-2L。在37°C下培养16 h后，用2 ml新鲜Opti-MEM（Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA）替换培养基，其中含有0.5μg蛋白酶抑制剂N个-对甲苯-苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）胰蛋白酶，然后在37°C下再培养细胞三天。然后将上清液接种到10天龄SPF胚胎卵的尿囊腔中。在39°C下孵育72小时后，收集尿囊液，并使用0.5%的鸡红细胞通过血凝试验鉴定病毒。从挽救的病毒中分离出病毒RNA，并通过RT-PCR和序列分析确认插入的外源基因的存在。被拯救的病毒被命名为rLa、rLa-H5w和rLa-H5m。
确认H5 HA在被拯救病毒感染的细胞中的表达。
通过Western blotting和免疫荧光分析证实H5 HA基因在重组NDV中的表达。如前所述进行Western blot分析(19). 用H5禽流感病毒HA基因DNA疫苗诱导的鸡抗血清作为一级抗体，用辣根过氧化物酶结合兔抗鸡免疫球蛋白G（IgG）（西格玛，圣路易斯，密苏里州）作为二级抗体。按照Huang等人的描述进行免疫荧光分析(14). 24孔板中的BHK-21细胞感染了挽救的病毒，感染指数为0.2。使用的主要抗体是针对H5N1禽流感病毒或新城疫病毒的特异性鸡多克隆血清。二级抗体为异硫氰酸荧光素结合兔抗鸡IgG（Sigma）。用荧光显微镜分析细胞。
重组病毒的稳定性和生长特性。
为了评估重组病毒外源基因的遗传稳定性，我们将该病毒在10天龄SPF鸡胚中传代20代。RT-PCR检测插入基因，免疫荧光法检测HA基因的表达。
为了研究H5N1禽流感病毒HA基因的插入是否影响NDV病毒的生长，我们接种了9日龄SPF鸡胚，接种量为0.1ml的100%鸡蛋感染剂量（EID）50)拯救的rLa、rLa-H5w或rLa-H5m病毒。采集每种病毒感染的六个卵子，每隔24小时收集一次，并在SPF卵子中滴定用于EID50.
体内重组病毒的特性。
测定平均死亡时间（MDT）、脑内致病性指数（ICPI）和静脉内致病性指标（IVPI），以评估OIE手册中描述的SPF鸡胚或SPF鸡体内重组病毒的致病性(24).
为了调查被拯救的病毒在鸡体内的复制位置和复制效果，对三组1周龄SPF鸡接种10只6EID公司50经眼给药的rLa、rLa-H5m或rLa-H5w，0.1-ml体积。在接种后第3天（p.i.）处死鸡，收集包括肺、肝、脾、肾和脑在内的器官进行病毒滴定。在第3天也从这些鸟身上采集拭子进行病毒滴定。
鸡的疫苗效力。
每组10只1周龄SPF鸡经眼给药接种10只6EID公司500.1毫升体积的被拯救的rLa、rLa-H5m或rLa-H5w病毒。在激发前收集血清，用OIE标准方法检测血凝素抑制（HI）抗体。每只鸡注射三周后，用10只三50%鸡致死剂量（CLD50)高致病性NDV F48E9通过肌肉注射或鼻内注射10三CLD公司50高致病性H5N1 GS/GD/96和BHG/QH/05。在H5N1禽流感病毒攻击后第3天、第5天和第7天（p.c.）采集鸡的口咽拭子和泄殖腔拭子进行病毒滴定，并在攻击后2周观察鸡的疾病症状和死亡情况。将两组10只接受重组病毒的鸡饲养4个月，观察HI抗体持续时间。
为了评估攻击病毒在鸡体内的复制，对9只鸡进行rLa或rLa-H5w疫苗接种，并如上所述用GS/GD/96或BHG/QH/05进行攻击。在第3天、第5天和第7天分别处死各组的三只鸡，并收集包括肺、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和大脑在内的器官，以便按照前面所述在鸡蛋中进行病毒滴定(19). 收集拭子进行病毒滴定。
老鼠研究。
3周龄BALB/c小鼠组接种10只8EID公司50以0.1毫升的体积腹膜内注射rLa或rLa-H5w病毒，然后在3周后用相同的剂量和相同的接种途径加强。小鼠在增强后2周内出血，然后用10只进行鼻内激发三小鼠致死剂量的50%（MLD50)同源BHG/QH/05病毒和异源DK/FJ/02病毒。每组三只小鼠于下午3天和6天被处死，收集包括鼻鼻甲、肺、脾、肾和脑在内的器官，按照前面所述在鸡蛋中进行病毒滴定(5). 在两周内观察了五只小鼠的疾病症状、体重变化和死亡情况。
序列分析。
对用于病毒拯救的质粒和被拯救的病毒进行了完全测序，以确认没有意外突变。使用RNeasy迷你试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚QIAGEN）从尿囊液中提取病毒RNA，并使用特定引物进行逆转录和扩增（如表所示). PCR产物用QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN）纯化。利用CEQ 8000 DNA测序仪（Beckman Coulter）上的CEQ DTCS-Quick Start试剂盒和一组基因特异性引物（序列可根据要求提供）对质粒和PCR产物进行测序。
血清学测试和病毒滴定。
根据OIE标准进行血凝抑制试验(24). 每个拭子在1ml冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）中清洗，并在10天龄SPF鸡胚中进行病毒滴定，并使用Reed和Muench方法进行计算(30).
实验室设施。
所有与HPAIV相关的实验均在P3设施中进行。
结果
产生表达H5N1禽流感病毒野生型和突变型HA基因的重组NDV病毒。
我们通过组装10个重叠的PCR片段，将NDV LaSota的15186个核苷酸和T7聚合酶启动子、HDV核酶和T7聚合酶终止子序列插入质粒pBR322中，构建了NDV LaSota的感染性克隆。H5N1禽流感病毒的野生型和突变HA基因插入NDV cDNA的P和M基因之间（图。). 如材料和方法中所述，从cDNA中拯救得到的重组病毒rLa-H5w和rLa-H5m，并通过RT-PCR证实HA基因的存在。感染BHK-21细胞的rLa-H5w和rLa-H5m表达的流感病毒H5 HA经免疫染色证实，如预期的那样，感染rLa的细胞未被H5 AIV HA蛋白的鸡抗血清染色，但使用NDV的鸡多克隆抗血清免疫染色阳性（图。). 相反，用rLa-H5w或rLa-H5m感染的细胞被H5禽流感病毒HA蛋白的鸡抗血清以及抗NDV抗血清染色。Western分析也证实了重组病毒表达野生型和突变型HA蛋白。如图所示。rLa-H5w表达的野生型HA蛋白大部分被裂解，而rLa-H5m表达的缺失裂解位点的突变型HA蛋白大量被解离。
H5 HA基因重组NDV的制备与鉴定。（A） 在P和M基因（I）和插入PmeI位点的野生型H5 AIV HA基因（II）或突变的H5 AIV-HA基因（III）之间引入PmeI位置的rLa基因组示意图。（B） H5禽流感病毒HA蛋白表达的免疫荧光分析。汇合的BHK-21细胞以0.2的MOI感染rLa（I）、rLa-H5w（II）或rLa-H5m（III）。用鸡抗NDV抗血清（a，d，g）、鸡抗H5禽流感病毒抗血清（b，e，h）或非感染（NI）SPF鸡血清（c，f，i）固定并探测感染细胞，然后用异硫氰酸荧光素结合的兔抗鸡IgG（Sigma）孵育。用徕卡DMIRE2荧光显微镜（徕卡）分析细胞。（C） 表达AIV H5的NDV重组子的Western blot分析。感染rLa、rLa-H5w或rLa-H5m的细胞裂解液与H5 HA基因DNA免疫（I）或鸡抗NDV抗血清（II）产生的鸡H5 AIV HA特异性抗血清孵育。与过氧化物酶偶联二级抗体孵育后，用3,3′-二氨基联苯试剂观察结合情况。标记蛋白的位置显示在左边，AIV血凝素的未纯化（HA0）和加工形式（HA1和HA2）显示在右边。
获救NDV重组病毒的生物学特性和稳定性。
MDT、ICPI和IVPI试验是国际公认的NDV毒株致病性评估方法(24). NDV株系根据MDT分为三类：快速型（小于60小时）、中胚层型（60至90小时）和透镜型（大于90小时）(24). rLa、rLa-H5w和rLa-H5m病毒的MDT值大于120小时，表明它们表现为透镜病毒（表). rLa的ICPI值为0.4，八只接受rLa病毒脑内注射的鸡中有两只在第1天出现疾病症状，第2天死亡。接受两种NDV重组病毒rLa-H5w和rLa-H5m的鸡在观察期内保持健康，重组病毒的ICPI值为零。静脉注射病毒后，所有鸡在观察期内保持健康，病毒的IVPI值为零（表). 这些数据表明，挽救的重组病毒在鸡胚和鸡体内减弱，表明HA基因的插入并没有增加载体NDV病毒的毒力。
表2。
| 病毒 | MDT（小时） | 鸡的致病性
| p.i.第3天肺部的病毒滴度（对数EID50/g）一 | p.i.第3天病毒脱落（记录EID50/毫升）b条 |
|---|
| ICPI公司 | IVPI公司 |
|---|
| 拉脱维亚共和国 | >120 | 0.4 | 0 | 2.0 ± 0.4 | 2.7 ± 0.3 |
| rLa-H5w型 | >120 | 0 | 0 | 1.2 ± 0.4 | 2.0±0.5 |
| rLa-H5米 | >120 | 0 | 0 | 1.2 ± 0.3 | 2.0 ± 0.8 |
为了调查被拯救病毒的复制情况，我们在p.i.第3天采集接种鸡的器官和拭子，并滴定鸡蛋中的病毒。在p.i.第3天，从鸡的肺部和口咽拭子中检测到病毒，但没有从任何其他器官或泄殖腔拭子检测到病毒（表). 这些数据表明，被拯救的病毒只能在接种鸡的呼吸道中复制。
为了研究H5禽流感病毒HA基因的插入是否影响新冠病毒载体病毒的生长特性，我们在鸡蛋中接种后的不同时间点采集并滴定病毒。如图所示。，两种重组病毒rLa-H5w和rLa-H5m同样生长良好，最高滴度为9.5log EID50/尽管滴度比病毒rLa的滴度低约半个对数，但在接种后72小时，滴度为ml。
重组病毒在胚胎卵中的生长特性。获救的NDV rLa（⋄）、rLa-H5w（\8900 ;）或rLa-H5m（○）（0.1 ml 100 EID50)将其接种到10天龄胚胎蛋的尿囊腔中，在接种后24、48、72和96 h的时间点采集每组6个蛋的尿囊液，并汇总用于EID的测定50鸡蛋；所示数据来自三个重复序列。
为了测定重组病毒中HA基因的稳定性，将rLa-H5m和rLa-H5w在10天龄SPF鸡胚中传代20次。RT-PCR证实了每一代病毒中都存在HA基因，序列分析表明，即使在鸡胚中传代20代后，HA基因裂解位点的野生型和突变序列同源性仍得以保留和稳定保持（数据未显示）。免疫荧光分析也证实了各代感染细胞中HA蛋白的表达（数据未显示）。重组病毒在鸡胚中传代20代后，保持了相似的MDT、ICPI和IVPI值。
鸡对NDV和H5N1禽流感病毒挑战的保护效力。
检测了重组病毒对NDV和AIV的保护效力，并研究了这些重组病毒作为二价疫苗的潜力。为了确定重组病毒对高致病性NDV的保护效力，我们用10三CLD公司50高致病性F48E9 NDV接种后3周（p.v.）。如表所示，用rLa和重组病毒免疫的鸡完全免受NDV的攻击，两周内没有出现疾病或死亡迹象。相反，对照组中的所有鸡在3天内死亡。
表3。
| 疫苗 | 新城疫病毒HI抗体滴度（对数2)一 | 鸡的表现b条
|
|---|
| 病号/总数 | 死亡人数/总数 |
|---|
| 拉脱维亚共和国 | 7.3 ± 0.4 | 0/10 | 0/10 |
| rLa-H5钨 | 6.6 ± 0.3 | 0/10 | 0/10 |
| rLa-H5米 | 6.8 ± 0.4 | 2010年0月 | 0/10 |
| 美国公共广播电视公司 | <1 | 10/10 | 10/10 |
与中国早期分离的H5N1病毒相比，BHG/QH/05是一种抗原漂移病毒（图。). BHG/QH/05的HA基因与GS/GD/96病毒的HA基因具有约95%的同源性。为了确定重组病毒是否能够诱导对同源病毒和异源H5流感病毒的保护，我们用同源病毒BHG/QH/05和早期分离物GS/GD/96攻击接种过的鸡。接种疫苗三周后，我们收集血清并检测其对不同攻击病毒的HI抗体滴度。如表所示、rLa-H5w和rLa-H5m诱导的HI抗体平均滴度为8.8log2和8.9 log2分别是。rLa-H5m和rLa-H5w诱导的异源病毒GS/GD/96的HI抗体平均滴度为4.2 log2和4.3日志2分别是。当我们用10只鸡挑战时三CLD公司50在不同的病毒中，接种疫苗的禽类完全免受同源和异源H5流感病毒的攻击。未观察到病毒脱落、临床症状或死亡。在BHG/QH/05攻击的对照组鸡中，气管和泄殖腔均检测到高滴度的病毒脱落，动物在攻击后第3天或之前死亡。在用GS/GD/96攻击的对照鸡组中，所有动物都会产生高滴度的病毒，并在下午5天之前死亡（表).
H5N1病毒血凝素基因的系统发育关系。这棵树包括2003年至2005年在东南亚国家分离的禽流感病毒和2005年至2006年在中东、欧洲和非洲分离的病毒。系统发育树是用CLUSTALX软件包（1.81版）的PHYLIP程序通过使用邻居连接算法并基于1000的引导值生成的。强调了用于重组疫苗生产的HA基因供体病毒，本研究中使用的挑战性病毒用斜体标记。CK，鸡肉；DK、鸭子；GS，鹅；MD，野鸭；有限公司，疣鼻天鹅; 复写的副本，大天鹅; 远景：大天鹅。
表4。
重组疫苗对鸡高致病性H5N1禽流感病毒攻击的保护作用一
| 挑战病毒 | 疫苗 | HI抗体滴度（对数2)b条 | 从拭子中分离病毒（脱落/总数[log10EID公司50])c（c）
| 存活率/总数 |
|---|
下午3天。
| 下午5天。
|
|---|
| 口咽的 | 泄殖腔 | 口咽的 | 泄殖腔 |
|---|
| GS/GD/96标准 | rLa-H5米 | 4.2 ± 0.6 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 10/10 |
| rLa-H5钨 | 4.3 ± 0.4 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 2010年0月 | 10/10 |
| 拉脱维亚共和国 | <1 | 10/10（3.1±0.3） | 10/10 (2.7 ± 0.4) | 3/3 (2.4 ± 0.7) | 3/3 (2.8 ± 0.3) | 0/10 |
| 钻孔G/QH/05 | rLa-H5米 | 8.8 ± 0.9 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 10/10 |
| rLa-H5钨 | 8.9 ± 0.7 | 2010年0月 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 10/10 |
| 拉脱维亚共和国 | <1 | 10/10 (2.8 ± 0.1) | 10/10 (3.1 ± 0.4) | —d日 | —d日 | 0/10 |
另一项实验是评估挑战病毒在鸡器官中的复制。如表所示rLa疫苗组中的GS/GD/96和BHG/QH/05病毒在所有受试器官中复制到高滴度，并于p.c第3天从口咽拭子和泄殖腔拭子中检测到，在p.i.第3天从一只鸡的肺、脾、肾和脑中检测到挑战病毒GS/GD/96，滴度超过104-比rLa病毒接种组的相应器官中的那些低数倍。rLa-H5w接种鸡的拭子中未检测到病毒脱落（表). 这些数据表明，表达H5流感病毒HA的基于重组新冠病毒的疫苗对同源和异源H5N1流感病毒的攻击是有效的，并且它们也是提供抗致病性新冠病毒攻击保护的二价疫苗。
表5。
| 挑战病毒 | 疫苗 | 下午3天鸡器官中的病毒复制（log EID50/g）b条
| 每天第3天病毒脱落（记录EID50/毫升）c（c）
|
|---|
| 肺 | 肝脏 | 脾脏 | 肾 | 心脏 | 大脑 | 口咽的 | 泄殖腔 |
|---|
| 钻孔G/QH/05 | rLa-H5钨 | — | — | — | — | — | — | — | — |
| 拉脱维亚共和国 | 7.8 ± 0.2 | 6.9±0.8 | 6.6 ± 1.2 | 7.2 ± 0.7 | 7.6 ± 0.7 | 5.8 ± 0.2 | 3.4 ± 0.3 | 2.9 ± 0.3 |
| GS/GD/96标准 | rLa-H5钨d日 | 2.5 | — | 1.5 | 1.5 | — | 1.5 | — | — |
| 拉脱维亚共和国 | 6.5 ± 0.8 | 6.0 ± 0.3 | 5.9 ± 0.5 | 6.8 ± 0.7 | 6.0 ± 0 | 5.5 ± 0.3 | 2.9 ± 0.5 | 3.2 ± 0.4 |
被拯救病毒诱导的鸡抗体反应。
HI抗体是预防AIV和NDV感染所必需的。为了研究被拯救病毒诱导的抗体反应，10只3周龄SPF鸡被接种10只6EID公司50对这些病毒进行了四个月的随访。每周在接种疫苗前后收集所有鸡的血清样本，以分析H5 AIV和NDV的HI抗体滴度。接种rLA-H5w或rLA-H5m的两组鸡对NDV和H5N1禽流感病毒的抗体滴度没有差异，因此，rLA-H5w病毒感染鸡的滴度仅显示在图中。NDV和H5 AIV的平均HI抗体滴度分别达到2.7和3.8 log2在一周p.v.时，H5禽流感病毒的平均滴度达到8.8 log的峰值2第3周，逐渐降至4.8 log218周时，NDV的HI抗体滴度也达到6.5 log的峰值23周后逐渐降至4.2 log2这些结果表明，基于NDV的重组疫苗可诱导保护性抗HA抗体反应，这种反应持续四个月以上。
重组病毒rLa-H5w在SPF鸡体内诱导的HI抗体持续时间。将10只1周龄Leghorn SPF白鸡眼接种6EID公司50将拯救的重组病毒rLa-H5w置于50μl中。每周收集血清，检测NDV（⋄）和H5N1 AIV（○）的HI抗体。数据表示为平均值±标准偏差。
小鼠对H5N1禽流感病毒攻击的保护作用。
各组小鼠接种两次剂量的108EID公司50在3周龄时腹腔注射rLa或rLa-H5w病毒，然后在6周龄时通过相同的给药途径接种相同剂量的疫苗。第二次接种疫苗两周后，我们用10只三MLD公司50高致病性H5N1病毒BHG/QH/05和DK/FJ/02。如表所示，未从下午3天和6天死亡的rLa-H5w接种小鼠的任何器官中检测到病毒，并且，在下午6天，从两种病毒攻击的小鼠的肺和脑中也分离出了高滴度的病毒。在这两个时间点，没有从任何小鼠的脾脏中检测到病毒。每组留五只小鼠观察临床症状和死亡情况。在接种rLa的组中，小鼠在下午3天开始出现皱褶毛皮和体重减轻（图。)，所有小鼠在9天内死亡。（图。). 然而，接受rLa-H5w病毒的小鼠在观察期内保持健康并存活下来（图。; 表). 在鸡体内观察到的基于NDV的重组疫苗对同源和异源流感病毒攻击的保护效力也扩展到了小鼠。
接种不同H5N1病毒的小鼠经鼻致命攻击后的结果。（A） 接种rLa（▴，▪) 或rLa-H5w（ω，□），并通过1000 MLD鼻腔接种进行激发50流感病毒BHG/QH/05（▴）或DK/FJ/02（□，▪) 第二次免疫后两周。平均重量损失表示为原始重量的百分比。
表6。
重组疫苗对高致病性H5N1禽流感病毒攻击小鼠的保护作用一
| 挑战病毒 | 疫苗 | HI抗体平均滴度b条 | 小鼠器官中的病毒复制（log10EID公司50)c（c）
| 存活率/总数 |
|---|
下午3天。
| 下午6天。
|
|---|
| NT公司 | 肺 | 脾脏 | 肾 | 大脑 | NT公司 | 肺 | 脾脏 | 肾 | 大脑 |
|---|
| 钻孔G/QH/05 | rLa-H5钨 | 160 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | 5/5 |
| 拉脱维亚共和国 | <10 | 3.0 ± 0.3 | 4.6 ± 0.2 | — | 1.3 ± 0.2 | 1.5 ± 0.1 | — | 4.2 ± 0.1 | — | — | 2.0 ± 0.2 | 0/5 |
| 丹麦/福建/02 | rLa-H5钨 | 20 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | — | 5/5 |
| 拉脱维亚共和国 | <10 | 2.0 ± 0.3 | 3.3±0.2 | — | 1.3 ± 0.1 | 1.2 ± 0.2 | — | 4.5±0.2 | — | — | 2.2 ± 0.3 | 0/5 |
讨论
我们利用反向遗传学方法制备了表达H5N1禽流感病毒野生型或突变型HA基因的重组NDV，并评估了其作为对抗致病性流感感染和致病性NDV感染的二价疫苗的潜在用途。在单次免疫剂量后，表达野生型或突变型HA的重组病毒在鸡体内诱导了对NDV和H5 AIV的强烈HI抗体反应，保护了鸡免受高致病性NDV的疾病症状和死亡。最重要的是，接种疫苗的鸡完全免受同源和异源H5N1病毒的攻击，并且没有病毒脱落、疾病迹象或死亡。我们还确定，表达野生型HA的重组病毒可以在小鼠中诱导对致命剂量的同源和异源H5N1病毒攻击的完全保护。我们的结果表明，重组病毒可以作为活二价疫苗，对高致病性NDV和H5流感病毒株的感染提供保护。
重组NDV的疫苗效力可能受到几个因素的影响。载体病毒的复制能力是一个重要的决定因素。目前，两株NDV减毒株B1和LaSota已被用作重组疫苗构建的载体。Swayne等人(35)利用高度减毒的新城疫病毒B1株构建重组病毒表达H7禽流感病毒HA基因，该重组病毒对高致病性H7 AIV或NDV攻击仅提供40%的保护。我们实验中使用的LaSota病毒比B1株弱，我们的研究以及其他研究表明，与B1株相比，基于LaSota的重组疫苗对NDV和靶向病原体的攻击提供了更好的保护(14,38).
外源基因的插入位点也影响重组NDV的免疫原性和疫苗效力。NDV基因组包含6个基因，序列为3′-NP-P-M-F-HN-L-5′(9). 蛋白质的表达水平从病毒基因组的3′端到5′端依次减弱(17,27). Huang等人(14)将传染性法氏囊病病毒VP2基因插入NDV LaSota基因组的远3′端，一次给药后，合成的病毒对高致病性新城疫病毒的攻击仅诱导90%的保护，而野生型NDV病毒诱导100%的保护。我们选择将外源HA基因插入NDV基因组中5′以上的位置，假设外源HA基因的表达比Huang等人选择的HA基因插入基因组的3′末端更弱。这些结果可能表明，外源基因的过度表达可能会损害重组病毒在体内的复制，并降低其作为疫苗的效力。
在构建重组疫苗病毒时需要检查的一个问题是，引入外源基因不会增加疫苗病毒载体的毒力。禽流感病毒HA基因是该病毒的一个非常重要的毒力因子，在裂解位点附近存在多种碱性氨基酸是H5和H7亚型AIV致病性的先决条件。在本研究中，我们生成了两个重组NDV，一个表达野生型HA，另一个表达突变型HA，其中缺失了切割位点中的多种碱性氨基酸。表达野生型和突变型HA基因的两种重组NDV病毒的生物学特性没有可检测的差异，这表明HA基因裂解位点中存在多种碱性氨基酸并不影响NDV LaSota载体的毒力。
流感病毒在自然界的流通过程中很容易发生抗原漂移，疫苗与流通病毒的抗原匹配是决定疫苗预防流感病毒复制和传播效果的最决定性因素之一。因此，有必要选择一种与自然界流行病毒密切匹配的病毒作为HA基因供体用于重组疫苗病毒的产生。我们报告说，H5N1病毒的几个基因型导致了中国西部野生鸟类的暴发，其中一个基因型的H5N1流感病毒传播到蒙古、中东、欧洲和非洲，成为世界上分布最广的H5N1病毒（图。). 因此，在本研究中，我们选择了BHG/QH/05的HA基因来产生重组病毒。我们的挑战性研究表明，表达BHG/QH/05的H5 HA基因的重组疫苗不仅能诱导对同源病毒的完全保护，还能诱导广泛的交叉抗体反应，并对抗原不同的早期分离物GS/GD/96提供完全保护。
在手稿准备期间，两个实验室公布了实验结果，也描述了抗流感NDV重组疫苗的生成。与这两个实验室观察到的情况相比，我们针对流感的重组新冠病毒疫苗在鸡中提供了更大的保护，使其免受同源和异源流感病毒的攻击，并且动物仍然更健康，完全没有病毒脱落或疾病症状。Park等人(25)使用一株复制能力增强的改良NDV B1菌株产生重组NDV，以表达插入NDV P和M基因之间的H7 HA的外域序列。他们的重组NDV对NDV攻击提供100%保护，对高致病性H7 AIV攻击仅提供90%保护。我们观察到对NDV和致病性H5 AIV挑战的100%保护。同样，所使用的不同NDV株的复制能力可能存在差异，这可能是我们实验中观察到的更高保护水平的原因。Veits等人(38)以LaSota衍生的NDV克隆30为载体，产生H5N2 HA NDV重组病毒，并将流感病毒HA基因插入克隆30的F和HN基因之间。这种重组病毒保护了鸡，使其免受致命的NDV和高致病性H5N2病毒的攻击，尽管一些鸡在受到H5N2-病毒攻击时表现出疾病症状。此外，该重组病毒诱导的H5禽流感病毒HI抗体水平相对较低。在我们的研究中，我们将H5 HA基因插入NDV基因组中的P和M基因之间，重组疫苗病毒诱导了NDV和H5N1 AIV的高水平HI抗体，并对致命的NDV和H5N1 AIV攻击提供了完全保护，没有动物表现出任何疾病迹象。这可能是因为我们的重组疫苗中使用了更多的5′插入位点，导致HA表达水平可能对NDV载体的复制能力及其作为疫苗的效力产生了积极影响。
Veits等人(38)另据报道，位于HA ORF内的NDV转录终止信号样序列（位于切割位点的多个碱性氨基酸序列内）可能限制HA基因的转录，从而限制重组NDV中HA蛋白尤其是HA2的合成。在本研究中，位于HA ORF内的NDV转录终止信号样序列在rLa-H5m病毒中被删除，但在rLa-H5w病毒中保持不变。rLa-H5m病毒表达的HA蛋白量与rLa-H5w相似，这两种重组病毒在鸡体内诱导了类似的HI抗体反应和对H5禽流感病毒的保护作用。此外，感染rLa-H5w的细胞中HA蛋白已完全表达并裂解为HA1和HA2，表明位于HA内的NDV转录终止信号样序列可能不影响HA基因的转录和HA2蛋白的合成和生成。
保护动物和人类免受致病性流感感染的大流行计划的优先事项是制定有效的疫苗战略。H5N1禽流感病毒可能会在人类中引发下一次流感大流行。活病毒载体疫苗为人类H5流感病毒感染提供了一种非常有希望的疫苗策略(11,13). 反向遗传学可以快速、大量生产候选流感活疫苗，克服传统灭活疫苗生产的时间和数量限制，这可能严重阻碍疫苗接种控制禽流感大流行传播的能力。使用新城疫病毒作为疫苗载体，通过反向遗传学生产抗流感活病毒载体疫苗，有几个优点，包括易于生产、产量高、易于在现场广泛给动物注射，以及基于新城疫病毒的重组病毒作为两种病毒的二价疫苗的潜力，这两种病毒可能会导致鸟类种群的大量死亡。此外，使用新城疫病毒作为疫苗主干应防止出于监测目的而混淆接种疫苗的禽类和受感染禽类，这是使用全病毒流感疫苗的一个问题。表达呼吸道人类病原体保护性抗原的NDV重组病毒的安全性和有效性最近在两种非人灵长类动物鼻内免疫后得到证实(三). 我们证明了我们研制的抗流感NDV重组病毒疫苗具有免疫原性，能够完全保护鸡和小鼠免受同源和异源致命H5N1病毒的攻击。上述因素强调，基于NDV的疫苗应被视为动物AIV感染的候选疫苗。此外，上述基于新城疫病毒的重组流感疫苗的优点及其在非人灵长类动物中的安全性和有效性，使基于新城疫疫苗的重组流感病毒疫苗成为一种诱人的候选疫苗，可进一步考虑用于人类，作为预防大流行性流感的潜在策略。
致谢
我们感谢伯纳德·莫斯提供表达T7 RNA聚合酶的改良痘苗病毒株安卡拉，感谢格洛丽亚·凯利编辑手稿。
这项工作得到了农业部动物传染病防治规划、国家重点基础研究计划（973）2005CB523005和2005CB5.23200以及国家科技计划2004BA519A19和2004BA519 A57的支持。
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