示踪染料探测大鼠肝细胞线粒体自噬

摘要

简介

自噬是一个消化受损、磨损和过剩的细胞器（如线粒体），并回收其氨基酸和其他营养物质用于其他用途的过程。禁食是肝脏自噬的有力诱导剂，这种作用部分由胰高血糖素介导，胰高血糖激素也是一种刺激肝糖原分解的激素。^1,2在营养应激期间，自噬是蛋白质降解的主要机制。^三,4相比之下，营养补充后，胰岛素抑制自噬并促进肝糖原的形成。⁵自噬在细胞中有两个重要功能：（1）清除多余和受损的细胞器，（2）在营养缺乏时释放游离氨基酸和其他营养物质。⁶当自噬受损时，如Atg7缺陷小鼠，变形的线粒体积聚在肝脏中。⁷

作为占肝细胞细胞质体积20%的细胞器，⁸线粒体是自噬的主要靶点。即使是营养良好的幼年动物，线粒体也会通过自噬每隔15到25天进行一次翻转。^9,10线粒体DNA（mtDNA）突变的线粒体也可以通过线粒体噬菌体清除。^11–13随着年龄的增长，线粒体通过自噬的降解似乎受到损害，从而促进线粒体DNA突变的积累和线粒体的损坏。溶酶体逐渐积累脂褐素，进一步损害线粒体的降解。¹²由于线粒体在某些情况下似乎是自噬的选择性靶向，^14,15线粒体自噬的特殊过程被称为有丝分裂。¹³

尽管针对线粒体进行有丝分裂的机制尚不清楚，但靶向过程的一个可能组成部分是来自线粒体的信号，线粒体将进行自噬。此前，我们提出线粒体通透性转换（MPT）代表了一种线粒体吞噬信号。¹⁴MPT是线粒体内膜高电导-通透性转换（PT）孔开放的结果。MPT后的肿胀导致外膜破裂，从而释放细胞色素c（c）和其他促凋亡因子进入胞浆。环孢菌素A（CsA）是一种免疫抑制性非肽类，可阻断MPT，并防止MPT依赖性坏死和凋亡细胞对肝细胞和其他细胞类型的杀伤。^16–19先前使用共焦荧光共振能量转移（FRET）技术鉴定去极化线粒体，研究表明CsA可以在自噬刺激和自噬体增殖后阻止线粒体去极化。这些观察结果支持以下结论：MPT在线粒体吞噬过程中启动线粒体去极化，并促进去极化线粒体在自噬体中的隔离。¹⁴

评估自噬和有丝分裂的方法依赖于定量电子显微镜等技术，以及用放射性同位素标记细胞蛋白后的放射性释放。^10,20,21最近，酸性细胞器的标记物，如单丹酰尸胺或LysoTracker Red（LTR）已被用于荧光显微镜研究自噬。^14,22显微镜的一个缺点是一次可以研究的细胞相对较少，并且无法进行高通量筛选。在这里，我们使用相关的总LTR荧光测量和共焦显微镜来评估LTR和MitoTracker Green（MTG）作为线粒体自噬探针。我们的结果表明，随着自噬刺激后溶酶体/自噬体室的扩大，总LTR摄取量增加。这种自噬主要涉及线粒体，线粒体在10分钟或更短时间内经历蛋白酶依赖的自噬消化。3-甲基腺嘌呤（3-MA）、阻断MPT和抑制磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）抑制自噬，抑制细胞LTR摄取。c-Jun N末端激酶（JNK）抑制剂，但不是其他应激激酶或半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂，也可以通过LTR摄取来阻断自噬。

材料和方法

结果

营养缺乏加胰高血糖素后培养肝细胞对LTR摄取的增加

由于其内部pH值较低，LTR在内切体、自噬体、溶酶体和自溶体（与溶酶体融合的自噬小体）中积累。为了确定用于微孔板阅读器分析的合适LTR浓度，肝细胞在KRH培养基或完全生长培养基中培养70分钟，然后加载不同浓度的LTR（25 nM至500 nM）(图1A). 荧光值归一化为完整生长培养基中LTR荧光的基线值，代表100%。与完全生长培养基相比，在KRH+胰高血糖素中培养后，LTR荧光的最大相对增加发生在50 nM时，而在完全生长培养液中，LTR摄取量从100±39%增加到了580±70%（n=12，p<0.001）。相比之下，与25、200和500 nM LTR孵育后，LTR荧光的相对增加较低。这些数据表明，50 nM LTR-对营养剥夺的荧光反应最大。为了确定70分钟是否代表自噬发育的足够时间，将肝细胞暴露于营养剥夺加胰高血糖素的环境中15、30、70和90分钟，然后加载50 nM LTR。在营养剥夺加葡聚糖素的环境下15分钟内，观察到LTR荧光增强。70分钟时达到最大荧光信号(图1B). 因此，在随后的实验中使用50 nM LTR和70 min的培养时间。

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图1

自噬刺激后培养肝细胞中LTR荧光增强。在（A）中，培养的肝细胞在完全生长培养基（GM）或KRH加1μM胰高血糖素（KRH+G）中培养70分钟后，加载25、50、200和500 nM LTR。再过20分钟，使用荧光板阅读器测量LTR荧光，如材料和方法中所述。在（B）中，肝细胞装载50 nM LTR，如（A）所述。然后在不同的培养时间后测量LTR荧光。*，p<0.001与完全培养基比较（n=12，25 nM LTR除外，其中n=4）。

为了检查LTR荧光的细胞内分布，将盖玻片上培养的肝细胞在完全生长培养基或KRH加胰高血糖素中培养70分钟。然后，用200 nM LTR加载肝细胞20分钟。在这些实验中，使用了更高浓度的LTR，因为初步实验表明，需要更多的LTR才能生成明亮、分辨率良好的共焦荧光图像。然后通过单个细胞的整个厚度收集连续的共焦图像，并叠加光学切片以表示占据LTR的细胞器的整个细胞补体。LTR摄取发生在离散的亚细胞器中(图2). 在用KRH和胰高血糖素孵育的肝细胞中，与完全生长培养基孵育肝细胞相比，LTR标记的细胞器数量显著增加，但细胞质的弥漫背景荧光没有改变(图2，比较左上下面板）。在KRH和胰高血糖素孵育的肝细胞中，LTR标记的细胞器数量增加，表明自溶体和自噬体形成。每个肝细胞的LTR标记细胞器数量与在多孔荧光板阅读器中测得的总LTR荧光密切相关。具体而言，在完全生长培养基中培养70分钟后，每个肝细胞的LTR标记细胞器数量从35±9个酸性细胞器/细胞（n=5个细胞）增加到在KRH和胰高血糖素中培养后的182±22个酸性细胞器官/细胞（p<0.001，n=6个细胞）。这520%的变化与平板阅读器测量的580%的LTR荧光变化非常接近(图1A). 相比之下，亮场显微镜显示，除了细胞间异质性引起的变化外，细胞几乎没有明显变化(图2，右侧面板）。因此，LTR标记细胞器数量的增加似乎是营养剥夺后荧光板读数测量到的LTR摄取增加的原因。

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图2

自噬诱导后肝细胞中LysoTracker Red（LTR）摄取的共焦和宽视野显微镜。将培养的肝细胞加载LTR（200 nM，20分钟），并在完整的生长培养基（GM，上部面板）或KRH加1μM胰高血糖素（KRH+G，下部面板）中培养70分钟。左图显示了生长培养基（左上图）或KRH加胰高血糖素（左下图）中肝细胞的红色LTR荧光的代表性叠加过焦共聚焦图像。右侧面板是相应的明亮图像。

自噬诱导后酸性细胞器对线粒体的消化

还收集了装载绿色荧光MTG的肝细胞的共焦图像的时间序列，以显示线粒体，以及显示酸性细胞器的红色荧光LTR。线粒体通过电泳吸收MTG，以响应线粒体膜电位的负值。摄取后，MTG与线粒体蛋白质共价结合，即使线粒体随后去极化，MTG仍留在线粒体中。^14,26通过与MTG和LTR共同标记，我们可以看到酸性自溶体内的线粒体包埋。在如所示的实验中图3，在所示视野内，在KRH加胰高血糖素中76.5分钟后，没有明显与LTR混贴。再过1.5分钟，箭头处的线粒体开始标记LTR并变黄。在接下来的几分钟里，这种标记变得越来越强烈。这些图像直接显示了单个线粒体转化为含线粒体的自噬体/自溶体。大约9分钟后，LTR标记结构消失。自溶体的消失要么是由于自噬消化的完成，要么是由于结构移出共焦像平面。通过打开共焦显微镜的针孔，使光学切片厚度达到2μm，从而将移出共焦平面导致的消失降至最低。共标记并不代表共聚焦切片平面内细胞器的随机重叠，因为包埋的MTG标记的线粒体始终完全在LTR标记的自噬体/自溶体内。与正常线粒体相比，由于水解消化，自噬体/自溶体结构中的MTG荧光逐渐减弱(图3和​和4A4A级).

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图3

自噬过程中的线粒体消化。将培养的肝细胞与MTG（0.5μM）混合60分钟，并在37°C的完全生长培养基中与LTR（0.5μM）混合20分钟。在显微镜台上，将完整的生长培养基替换为KRH加1μM胰高血糖素，并收集绿色MTG荧光和红色LTR共焦图像的时间序列。选择时间点来说明线粒体自噬消化的开始和完成。一个实验代表10人。

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图4

蛋白酶抑制剂延长线粒体自噬消化。在（A）中，将培养的肝细胞与MTG和LTR混合，放入KRH和胰高血糖素中，如图3在没有（左面板）和存在7.5μM胃蛋白酶抑制素A（右面板）的情况下。70分钟后，采集绿色MTG和红色LTR荧光的单共焦图像。向上指向的白色箭头表示与MTG标记的线粒体共定位的LTR标记的酸性细胞器。向下指向的黄色箭头表示不与MTG荧光共定位的LT标记的溶酶体。在（B）中，含有MTG荧光的LTR标记酸性细胞器的数量（黑条）和单个共焦光学切片（厚度约2μm）（黑条在无胃蛋白酶抑制素A（Pep A，7.5μM）或亮氨酸肽（Leu，10μM）的情况下绘制。在（C）中，MTG和LTR在个体自噬体中共定位的持续时间是根据KRH加胰高血糖素在存在和不存在蛋白酶抑制剂的情况下自噬刺激后共聚焦图像的时间序列确定的，如（A）所示。*，p<0.001 vs.无（n=6）。

3-甲基腺嘌呤、环孢霉素A和NIM811对自噬刺激后自噬体/自溶体增殖的抑制作用

3-MA是一种特征明确的早期自噬抑制剂。²⁷因此，我们测试了3-MA（10 mM）是否抑制自噬刺激后LTR荧光的增加。在KRH加胰高血糖素诱导自噬之前和之后，将肝细胞与3-MA在完全生长培养基中预孵育30分钟。3-MA抑制营养剥夺引起的LTR荧光增加85%(图5A). 为了评估通过LTR多孔分析评估的MPT抑制对自噬的影响，在营养剥夺诱导自噬之前和期间添加CsA（5μM）。CsA治疗抑制LTR荧光增加63%(图5A).

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图5

LTR荧光板阅读器筛选试验：通过抑制MPT、PI3激酶和JNK的药物抑制自噬，但不通过抑制caspases、ERK1和p38的药物抑制。将生长培养基中培养的肝细胞在完全生长培养基预培养30分钟，然后在生长培养基（GM）或KRH加1μM胰高血糖素（KRH+G）中培养70分钟。添加LTR（50 nM），并按照材料和方法中的描述测量LTR荧光。如前所述，从30分钟预培养开始添加各种抑制剂。使用的药物有：（A）、10 mM 3-MA、5μM他克莫司（钙调神经磷酸酶抑制剂）、5μM NIM811（MPT抑制剂）、5M CsA（钙调神经元磷酸酶和MPT抑制剂；（B） ，0.5μM沃特曼，10μM LY294002（PI3激酶抑制剂）；C、 100μM DEVD-fmk（caspase 3抑制剂）、100μM IETD-fmk；D、 10 mM 3-MA、100μM PD98059（ERK1抑制剂）、100μM SB203580（p38抑制剂）、10μM SCP25041（JNK抑制剂）、20μM SP600125（JNK抑制剂）。*，与KRH+G相比，p<0.001（每组n=12-16，SP600125除外，其中n=4）。

虽然CsA在所用浓度下特异性抑制MPT，但CsA也抑制Ca²⁺-依赖性蛋白磷酸酶，钙调神经磷酸酶，CsA免疫抑制特性的基础。²⁸因此，用N-甲基-4-异亮氨酸环孢菌素（NIM811，5μM）培养肝细胞，这是一种非免疫抑制性CsA类似物，可阻断MPT但不抑制钙调神经磷酸酶。²⁹NIM811对营养剥夺后LTR荧光增强的阻断作用与CsA几乎相同(图5A). 相比之下，他克莫司（5μM），一种不阻断MPT的免疫抑制性钙调磷酸酶抑制剂，没有抑制自噬(图5A).

讨论

自噬负责细胞器的降解和周转，包括线粒体（在^{参考文献。37}和³⁸). 由于细胞器占肝细胞胞浆体积的20%，⁸线粒体是体内禁食和体外营养缺乏后自噬消化的常见靶点。在这里，我们使用LTR和MTG来表征营养剥夺期间大鼠肝细胞自噬的动力学，特别是线粒体自噬（有丝分裂）的动力学。我们还开发了一种高通量多孔板分析法，以基于酸性细胞器标记物LTR的摄取来测量培养肝细胞中的自噬。通过板读取器中的红色荧光测量，LTR摄取量在营养剥夺后增加了4到6倍，并被经典的自吞噬抑制剂3-MA阻断(图1,5A和D). 荧光板读数测量的LTR摄取增加与共焦显微镜观察的大酸性结构增殖相关(图2，右图），营养剥夺后的大多数大型酸性细胞器含有MTG标记的线粒体残留物，这些残留物明确地将结构鉴定为自噬体/自溶体(图3).

自噬体和自溶体的增殖是自噬进展的基本特征。新隔离的自噬体几乎立即发生酸化，随后需要与溶酶体囊泡融合。^39–41这里使用共焦显微镜，我们显示了线粒体自噬或有丝分裂的时间进程，这是以前仅通过电子显微镜推断的(图3).^10,39,42通过对含有自噬体和其他酸性细胞器标记物LTR和线粒体标记物MTG的肝细胞进行时间成像，我们直接观察到了线粒体吞噬的进展，并观察到线粒体的自噬消化平均在7.5分钟内完成。因此，大约一半自噬体中的MTG在自噬隔离7.5分钟内消失。MTG在电泳积累到极化线粒体后与线粒体蛋白质共价结合。^14,26因此，自溶酶体中MTG的丢失表示由于线粒体肽片段的溶酶体消化或MTG与线粒体蛋白质之间共价键的断裂而释放。我们观察到的消化半衰期与早期电子显微镜的估计很一致，即在体内用胰岛素阻断新自噬体形成后，大鼠肝脏中自噬小体和自溶小体消失的半衰期约为9分钟。¹⁰此外，我们还发现，蛋白酶抑制剂leupeptin和胃蛋白酶抑制素A显著减缓了这种消化，正如自噬过程所预期的那样(图4). 在这里研究的培养肝细胞中，自噬刺激主要产生线粒体自噬，因为与LTR和MTG共载后，75%的LTR标记的酸性细胞器含有MTG标记的线粒体(图4A和B). 剩下的25%可能代表非线粒体自噬或线粒体消化完成后的溶酶体残留。

使用LTR荧光分析，我们显示MPT孔抑制剂CsA和NIM811抑制自噬，而钙调神经磷酸酶抑制剂他克莫司则没有(图5A). 此外，PI3激酶抑制剂沃特曼和LY294002抑制了营养剥夺诱导的自噬(图5B). 最后一项发现与之前的报告一致，即PI3激酶抑制剂抑制自噬，3-MA本身是PI3激酶抑制物，III类PI3激酶是细胞内膜转运的重要调节器。^33,34,43该发现也与我们实验室先前的报告一致，即CsA抑制线粒体自噬。¹⁴总之，这些发现为LTR多孔板自噬试验提供了有力的验证。我们还研究了抑制各种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶对自噬的影响，包括泛天冬氨酰蛋白酶抑制（z-VAD-fmk）、启动子半胱氨酸蛋白酶-8的抑制（IETD-fmk(图5C). 然而，所测试的胱天蛋白酶抑制剂均未产生任何具有统计学意义的自噬变化。

哺乳动物细胞利用MAPK超家族蛋白激酶将细胞外信号转导到细胞反应中，MAPK在调节凋亡信号中起着重要作用。^35,36在这里，我们发现PD98059抑制ERK1和SB203580抑制p38并没有减少营养剥夺和胰高血糖素诱导的自噬。相反，SCP25041和SP600125对JNK的抑制降低了通过LTR摄取评估的自噬，表明这种激酶在自噬诱导中的作用(图5D). 通过LTR标记肝细胞的共焦显微镜评估，JNK抑制也抑制自噬体增殖（数据未显示）。最近的研究表明，JNK抑制剂可以阻止一种称为自噬细胞死亡的程序性细胞死亡。^37,44,45然而，根据碘化丙啶核染色和形态学变化的评估，在我们通过营养缺乏进行自噬刺激的条件下，没有发生细胞杀伤(图2和数据未显示）。因此，JNK对诱导自噬的作用可能是直接的，而不是次要的诱导细胞死亡过程。尽管如此，JNK参与自噬的药理证据和特征的确认仍需要进一步研究。

LTR是一种嗜酸荧光探针，用于标记和追踪活细胞中的酸性细胞器（参见^参考46). LTR标记所有酸性细胞器，包括溶酶体、自噬体、晚期内体，以及在较小程度上，酸性不如其他酸性细胞器的早期内体。荧光板阅读器测得的LTR荧光代表酸性细胞器的相对总质量，我们在营养剥夺加上胰高血糖素后观察到的LTR荧光素增加可能代表任何酸性细胞器增殖。然而，在我们的分析中，LTR荧光增强很可能代表自噬体和自溶体的增加，原因有几个。首先，营养剥夺和胰高血糖素这两种强烈的自噬刺激物诱导了LTR荧光的增加(图1和5A–D段). 其次，阻断自噬的药物，包括3-MA、MPT阻滞剂和PI3激酶抑制剂，抑制了营养剥夺加胰高血糖素后LTR荧光的增加(图5A和B). 第三，通过共焦显微镜对肝细胞进行成像，发现肝细胞增殖了相对较大的LTR染色结构，这些结构的大小和异质性与自噬体和自溶体一致，而不是与内体和初级溶酶体一致(图2–4). 第四，这些结构中的大多数含有MTG标记的线粒体，这些线粒体明确地将它们鉴定为自噬体/自溶体(图3).

营养剥夺也会上调细胞内吞，3-MA会抑制营养剥夺。^47,48虽然单个胞体/内体低于光学显微镜的分辨率，但由于内吞作用增加，LTR荧光增加，这将明显表现为细胞扩散LTR荧光的增加，这是未观察到的（参见图2). 这一观察结果加上内体的小尺寸及其比溶酶体弱的酸化作用，表明内吞作用的改变可能与自噬刺激后观察到的LTR荧光变化无关。

细胞摄取LTR的程度不仅取决于溶酶体/自噬体小室的大小，还取决于这些小室的酸度。因此，巴非霉素和莫能菌素等药物会抑制LTR的摄取，这些药物会破坏溶酶体/自噬体膜上的ΔpH值。因此，使用高通量荧光板阅读器筛选分析的“点击”应随后采用更具体的技术，如共焦显微镜，以确定LTR累积变化的基础。如果显微镜下显示溶酶体和自噬体对LTR的摄取较弱，而标记的小泡数量没有减少，则应怀疑ΔpH值降低。同样，增加腔内酸度可以增加LTR摄取。

此前，我们的实验室显示，单丹磺酰尸胺在大鼠肝细胞暴露于营养剥夺和胰高血糖素后标记这些增殖的酸性细胞器，¹⁴与早先的报道一致，单丹酰尸胺是一种自噬体标记物。²²作为一种弱胺，单丹磺酰基尸胺积累到酸性细胞器中，与LTR非常相似。⁴⁶在这种细胞器内，单丹酰尸胺的荧光因疏水环境而增强，即当酸性隔室中含有膜细胞自噬后发生的脂质时。⁴⁹然而，我们发现单丹磺酰基尸胺不适合用于多孔荧光分析，因为单丹磺胺酰基尸碱加载后背景荧光水平较高（数据未显示）。共焦显微镜显示，这种背景荧光在整个细胞中扩散，可能代表两亲性单丹酰尸胺插入不同的内膜。LTR产生的背景荧光少得多。

在荧光板阅读器分析中，营养剥夺后荧光的最大相对增加发生在50 nM LTR之后，可能是因为在此低浓度下非特异性背景荧光最小。然而，对于共焦成像，为了获得足够的灵敏度和空间信噪比，需要更高浓度的LTR。共焦成像很容易区分特异性LTR标记细胞器和弥漫性非特异性背景荧光。一般来说，应使用尽可能低的LTR浓度，以避免LTR引起的器官内酸度紊乱。

CsA对哺乳动物细胞具有双重抑制作用。^28,50一种作用是在线粒体基质空间与亲环素D结合以抑制MPT孔，另一种作用则是在胞浆中结合亲环素A以抑制钙调神经磷酸酶。钙调神经蛋白是一种蛋白质磷酸酶，抑制钙调神经元蛋白会导致许多蛋白质的磷酸化增加，可能包括那些调节自噬的蛋白质。这里的一项新发现是，NIM811在营养剥夺期间阻断自噬刺激的程度与CsA相同(图5A). NIM811是CsA的类似物，可以阻断MPT，但不抑制钙调神经磷酸酶。²⁹这一观察结果以及另一种钙调神经磷酸酶抑制剂他克莫司（tacrolimus）没有阻断自噬的事实，支持了MPT是启动线粒体自噬重要事件的结论。

尽管长期以来被认为是一个随机过程，但越来越多的证据表明，线粒体、过氧化物酶体和可能的其他细胞器的自噬可能是选择性的。^{13–15,17,51–53}因此，与过氧化物酶体自噬的pexophagy相类似，线粒体自噬一词适用于描述线粒体的自噬。¹³MPT参与自噬意味着促进MPT的因素，如线粒体Ca²⁺摄取、Pi增加、活性氧和氮物种、某些鞘磷脂以及细胞氧化还原状态的改变也可能调节自噬的速率和程度。目前正在对自噬中的这些因素进行解释。

总之，我们在此将LTR表征为培养大鼠肝细胞自噬的荧光探针。用荧光板阅读器测量的LTR荧光为监测营养剥夺和胰高血糖素刺激的自噬提供了一种快速、灵敏的方法，适合高通量筛选。相关共聚焦显微镜显示，这种自噬主要涉及线粒体，单个线粒体的蛋白酶依赖性自噬消化在10分钟或更短时间内发生。我们通过显示MPT和PI3激酶抑制剂抑制LTR摄取来验证荧光读取器分析，并且我们提供了新的证据表明JNK活性也可能参与自噬。然而，尽管JNK、MPT和PI3激酶参与促凋亡和抗凋亡调节，但胱天蛋白酶似乎在自噬反应的信号传导中没有作用。LTR的总荧光测量和荧光成像在筛选和表征作用于自噬途径的其他药物方面应该是有用的。

致谢

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参考文献