白细胞介素-1受体相关激酶-1在Toll样受体（TLR）7和TLR9介导的干扰素-α诱导中起重要作用

IRAK-1激酶活性

IRF7已被证明在病毒感染期间通过磷酸化COOH末端丝氨酸残基而被激活，并转位到细胞核中调节靶基因的表达，包括IFN-α(30). 因此，我们检测了IRAK-1的激酶活性是否对IRF7的激活是必要的。用FlAG–IRF7和IRAK-1的Myc–IRAK-1或Myc–激酶阴性（KN）突变体转染HEK293细胞。然后在表达IRAK-1和IRAK-1 KN的细胞中与抗Myc共沉淀FLAG–IRF7(图2A） ●●●●。我们在表达Myc–IRAK-1的细胞中检测到FLAG–IRF7的缓慢迁移形式，但在共表达IRAK-1 KN的细胞中没有检测到，这表明IRAK-1通过其激酶活性诱导IRF7磷酸化(图2A） ●●●●。为了确定IRAK-1是否可以磷酸化IRF7的COOH末端，我们使用细菌表达的GST-IRF7作为底物进行体外激酶分析。IRAK-1、IRAK-1 KN、IRAK-4和IRAK-4 KN在HEK293细胞中表达，细胞裂解物用抗FlAG免疫沉淀。在IRAK-1的免疫沉淀物中发现GST–IRF7的磷酸化，但在IRAK-4中未发现(图2B） ●●●●。这些数据表明，IRAK-1而不是IRAK-4在体外磷酸化IRF7。接下来我们测试了IRAK-1的激酶活性是否对IRF7的转录活性是必要的。在之前的工作中，我们通过共表达IRF7和MyD88显示了IFN-α启动子的协同激活(28). 然而，IRAK-1或IRAK-4与IRF7的过度表达均未导致HEK293细胞中IFN-α启动子的协同激活（未发表数据）。因此，我们将IRF7、MyD88和不同数量的IRAK-1 KN与携带IFN-α4启动子的报告质粒联合瞬时转染HEK293细胞。IRAK-1 KN以剂量依赖的方式抑制由MyD88和IRF7共表达诱导的IFN-α4启动子的激活，而IRAK-1 KN不抑制MyD88对NF-κB的激活。IRAK-1 KN的这种作用与仅包含COOH末端TRAF结构域（TRAF6C）的TRAF6截短突变形成鲜明对比，TRAF6作为显性阴性突变，干扰IFN-α4和NF-κB启动子的激活(图2C） ●●●●。这些数据表明IRAK-1在体外可以磷酸化IRF-7，IRAK-1的激酶活性对IRF7的转录活性是必需的，而对NF-κB的转录活性则不是必需的。

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图2。

IRAK-1激活IRF7。（A） 如图所示，从瞬时转染FLAG–IRF7的HEK293细胞以及Myc–IRAK1或Myc–IRAK1 KN制备的细胞裂解物用抗Myc或抗FLAG进行免疫沉淀，然后使用抗FLAG或抗Myc进行免疫印迹分析。（B） 用FLAG–IRAK-1、FLAG–IRAK-1 KN、FLAG-IRAK-4或FLAG–IRAK-4 KN瞬时转染HEK293细胞。细胞裂解物用抗FLAG免疫沉淀，并在GST–IRF7存在下进行体外激酶反应。蛋白质在SDS-PAGE上分离，然后通过放射自显影进行可视化。（C） 用IRF7、MyD88和1、10或50ng IRAK-1的KN突变体（IRAK-1 KN）的组合以及携带IFN-α4启动子的报告质粒（左）瞬时转染HEK293细胞。HEK293细胞还转染了MyD88和1、10或50 ng IRAK-1 KN的组合以及携带ELAM启动子的报告质粒（右）。转染36小时后，通过报告基因分析对细胞进行IFN-α4或ELAM依赖性启动子活性分析。

对A/D型CpG ODN的响应伊拉克-1 ^−/年pDC

为了阐明IRAK-1在TLR-介导的IFN-α产生中的体内作用，我们通过使用来源于伊拉克-1 ^−/年老鼠。大量IFN-α的产生来自伊拉克-1 ^+/Y（Y）Flt3L–观察到BMDC对A/D型CpG ODN，D35的反应(31). 然而，干扰素-α的产生在伊拉克-1 ^−/年Flt3L–BMDC。相反，伊拉克-1 ^+/Y（Y）和伊拉克-1 ^{− /Y（Y）}Flt3L–BMDCs对D35产生类似水平的TNF-α、IL-6和IL-12p40(图3A） ●●●●。此外，Northern blot分析显示，尽管IL-6 mRNA的诱导在伊拉克-1 ^−/年Flt3L–BMDCs，D35对IFN-α4mRNA的诱导也在伊拉克-1 ^−/年Flt3L–BMDC(图3B） 。

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图3。

D35对干扰素-α诱导的损伤伊拉克-1 ^-/Y（Y）老鼠。（A） Flt3L–BMDC来自伊拉克-1 ^{+ /Y（Y）}和伊拉克-1 ^{− /Y（Y）}用指示浓度的D35刺激小鼠24小时。用ELISA法测定培养上清中IFN-α、TNF-α、IL-6和IL-12p40的浓度。数据显示为Irak-1的平均值±标准偏差。（B）Flt3L–BMDC^+/年和伊拉克-1^{− /Y（Y）}用1μM D35刺激小鼠，持续指定时间。提取总RNA并进行Northern blot分析。（C） Irak-1来源的Flt3L–BMDCs的细胞内IFN-α和IL-12染色^+/Y（Y）和伊拉克-1^{− /Y（Y）}用3μM CpG DNA（D35）刺激小鼠。CD11c公司⁺B220型⁺Flt3L–BMDCs的群体分别作为pDC进行分析。

用Flt3L培养BM细胞可诱导两种pDC（B220⁺)和传统（B220⁻)跟单信用证(32). 虽然pDC是IFN-α产生的主要来源，但两种DC亚群都会产生前炎症细胞因子，如IL-12(4). 由于难以区分pDC中促炎细胞因子的诱导是否受损，我们进一步分析了B220中IFN-α和IL-12的产生⁺流式细胞术检测pDCs。Flt3L–BM–DC来自伊拉克-1 ^+/Y（Y）和伊拉克-1 ^−/年用D35刺激小鼠，并用干扰素-α或IL-12抗体染色，同时用CD11c和B220染色。流式细胞术分析显示，D35诱导IFN-α伊拉克-1 ^−/年B220型⁺pDCs与伊拉克-1 ^{+ /Y（Y）}B220型⁺pDC。另一方面，IL-12的产生在伊拉克-1 ^−/年B220型⁺pDC(图3C） ●●●●。这些结果表明TLR9配体诱导的IFN-α生成在伊拉克-1 ^{− /Y（Y）}pDC。

的响应伊拉克-1 ^−/年细胞与其他TLR配体

ODN1668、K型或传统CpG ODN可刺激野生型Flt3L–BMDCs在0.01至0.1μM的低浓度下产生IFN-α(24)虽然最大诱导值小于D35刺激的DC。与A/D型CpG ODN的结果类似，对ODN1668应答的IFN-α的产生在伊拉克-1 ^−/年Flt3L–BMDC。然而，其他细胞因子的产生，如TNF-α、IL-6和IL-12 p40在伊拉克-1 ^+/Y（Y）和伊拉克-1 ^−/年单元格(图4A） ●●●●。

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图4。

其他TLR配体对IFN-α的诱导作用伊拉克-1 ^−/年老鼠。（A） Flt3L–BMDC来自伊拉克-1 ^{+ /Y（Y）}和伊拉克-1 ^{− /Y（Y）}用指示浓度的ODN1668刺激小鼠24小时。通过ELISA测量培养上清液中IFN-α、TNF-α、IL-6和IL-12p40的浓度。数据显示为平均值±标准偏差。（B）伊拉克-1 ^{+ /Y（Y）}和伊拉克-1 ^{− /Y（Y）}老鼠(n个＝3）静脉注射50nmol的R-848。采集血清样本，用ELISA法测定IFN-α和IL-12p40的浓度。（C） Flt3L–BMDC来自伊拉克-1 ^{+ /Y（Y）}和伊拉克-1 ^{− /Y（Y）}用10μg/ml poly（I/C）转染小鼠24 h。用ELISA测定培养上清中IFN-α的浓度。数据显示为未检测到的平均值±标准偏差N.D。

由于TLR9配体诱导的IFN-α生成在伊拉克-1 ^−/年小鼠，我们还检测了TLR7介导的IFN-α诱导伊拉克-1 ^−/年老鼠。我们静脉注射伊拉克-1 ^+/Y（Y）和伊拉克-1 ^−/年用TLR7配体R-848检测小鼠血清IFN-α浓度。R-848注射后一小时内，伊拉克-1 ^+/Y（Y）小鼠的血清干扰素-α浓度增加，而血清干扰物-α水平在伊拉克-1 ^−/年老鼠。相反，IL-12p40的血清浓度在伊拉克-1 ^+/Y（Y）和伊拉克-1 ^−/年老鼠(图4B） ●●●●。这些结果表明，IRAK-1也参与了TLR7介导的IFN-α的产生。

排除干扰素-α产生中固有缺陷的可能性伊拉克-1 ^−/−小鼠，我们将双链RNA，poly（I/C）转染到来源于伊拉克-1 ^+/Y（Y）小鼠并测量IFN-α的产生。伊拉克-1 ^+/年和伊拉克-1 ^−/年Flt3L–BMDC对poly（I/C）的反应产生了类似水平的IFN-α(图4C） ，表明了这一点伊拉克-1 ^−/年小鼠具有产生IFN-α的能力。因此，IRAK-1特别参与TLR7-和TLR9-介导的IFN-α的产生。

老鼠

伊拉克-1^−/年小鼠由J.A.Thomas博士提供（德克萨斯大学西南医学中心，德克萨斯州达拉斯；18）。

细胞和试剂

Flt3L–BMDC的制备如前所述(24). 如前所述制备CpG寡核苷酸（D35和ODN1668）(24). R-848由日本能源公司制药和生物技术实验室提供(9). Poly（I/C）购自Amersham Biosciences，Inc.。Anti-IRF7、Anti-ERK和Anti-phosphalated-ERK分别购自Zymed Laboratories和New England Biolabs，Inc。

转染、免疫沉淀和免疫印迹分析

HEK293细胞（10⁶)在一个100毫米的盘子里播种。12小时后，将总计6.0μg的不同质粒与Lipofectamine 2000（Invitrogen）瞬时转染细胞。如前所述进行免疫沉淀和免疫印迹分析(28)。

FRET公司

如前所述，对HEK293细胞在胶原涂层玻璃皿上进行成像(28). 简而言之，细胞在配备冷却CCD摄像头的倒置显微镜上成像，并由MetaMorph软件（Universal Imaging Corp.）控制。在HEK293细胞中表达了一对与YFP或CFP融合的蛋白。使用以下滤波器组对细胞进行成像：用于CFP图像的MX0420激发滤波器和BP470-490发射滤波器（Olympus），用于FRET图像的MX0420激发过滤器和535DF35发射滤波器（欧米茄光学公司），以及510DF23激发过滤器（欧米加光学公司）以及用于YFP图像的560DF15发射滤波器（Omega Optical，Inc.）。在整个实验过程中使用了XF2052二向色反射镜（Omega Optical，Inc.）。CFP和FRET图像的曝光时间为200毫秒，YFP图像为100毫秒。数据采集后，测量CFP、FRET和YFP的平均强度，并通过由FRET分量组成的FRET滤波器组计算荧光强度（“校正”FRET、FRET^C类). 如前所述减去非FRET成分(28). 对于我们的实验条件，我们使用了以下方程式：FRET^C类=FRET−（0.34×CFP）−（0.02×YFP）。

为了流式细胞术分析FRET，将如上所述转染CFP和/或YFP融合蛋白的HEK293细胞重新悬浮在293表达介质（Invitrogen）中，并测量YFP（激发：488 nm；发射：530 nm）、CFP（激发：407 nm；发射：510 nm）、FRET（激发：40.7 nm；释放：535 nm）使用FAC aria（Becton Dickinson）和BD FACSDiVa软件。FRET表示为CFP激发获得的YFP发射除以CFP激发得到的CFP发射。

荧光素酶报告试验

HEK293细胞接种在24孔板（10⁵cells/well）瞬时转染100ng荧光素酶报告质粒和总计900ng的各种表达载体。然后，36小时后，用双荧光素酶报告基因测定系统（Promega）测量总细胞裂解物中的荧光素酶活性。同时转染肾素荧光素酶报告基因（50ng）作为内部对照。

酶联免疫吸附试验

Flt3-BMDC（10⁶细胞/孔）用不同浓度的CpG寡核苷酸D35和ODN1668刺激24小时。根据制造商的说明，通过ELISA测量培养上清液中TNF-α、IL-6、IL-12 p40和IFN-α的浓度（TNF-α和IL-12 p40的Genzyme，IL-6的R&D和IFN-α的PBL Bio Lab）。用ELISA法测定血清细胞因子IFN-α和IL-12 p40的浓度。

体外激酶测定

200万个HEK-293细胞接种在一个60毫米直径的培养皿中。24小时后，使用制造商规定的Lipofectamine 2000（Invitrogen）瞬时转染细胞，共转染5.0μg空质粒或指示质粒（2.0μg pFLAG-CMV2 IRAK-1或IRAK-1，4.0μg pFLAG-CMV2 IRAK-4或IRAK-4 KN）。转染36 h后收集细胞，进行裂解，然后用蛋白G–Sepharose和1.0μG抗FLAG M2单克隆抗体（Sigma-Aldrich）进行免疫沉淀，并旋转12 h。用裂解缓冲液洗涤珠子四次，用激酶分析缓冲液洗涤另外三次（20 mM Hepes，pH 7.5，20 mM MgCl₂，3 mM氯化锰₂和10 mMβ-甘油磷酸）。免疫沉淀剂与2.0μg GST-IRF7和10 mCi[γ-³²P] ATP（Amersham Biosciences）在30°C下保持30分钟。通过添加Laemmli样品缓冲液停止激酶反应，并在4~20%聚丙烯酰胺梯度凝胶上分离。凝胶被扣留、干燥并暴露于X射线胶片。

我们感谢James A.Thomas博士伊拉克-1 ^-/Y（Y）老鼠。我们感谢H.Tomizawa为FRET分析提供R-848和K.Terai和S.Tanaka（BD Biosciences）。我们还感谢N.Kitagaki的技术援助和M.Hashimoto的秘书协助。

这项工作得到了特别协调基金、教育、文化、体育、科学和技术部以及日本青年科学促进会研究金的资助。

作者没有相互冲突的经济利益。