美国国家科学院院刊。2004年6月15日；101(24): 9085–9090.
来自封面
Fbw7肿瘤抑制因子调节糖原合成酶激酶3磷酸化依赖性c-Myc蛋白降解
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马库斯·韦尔克
的分区*临床研究，†人类生物学，以及§华盛顿州西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心基础科学，邮编98109；∥华盛顿大学医学院医学系，西雅图，WA 98104；和¶哈佛医学院病理学系，马萨诸塞州波士顿02115
阿米尔·奥利安
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金建平
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乔纳森·格里姆
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J.韦德·哈珀
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罗伯特·艾森曼
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布鲁斯·克鲁曼
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‡M.W.和A.O.对这项工作做出了同等贡献。
Robert N.Eisenman撰稿，2004年4月19日
- 补充资料
支持性数字
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摘要
Myc蛋白调节细胞生长和分裂，并与多种人类癌症有关。我们在这里展示了Fbw7，SCF的一个组成部分飞行重量7泛素连接酶和肿瘤抑制剂促进蛋白酶体依赖的c-Myc转换体内和c-Myc泛素化在体外糖原合成酶激酶3使c-Myc在苏氨酸-58（T58）上磷酸化，调节Fbw7与c-Myc的结合以及Fbw7-介导的c-Myc降解和泛素化。T58是c最常见的站点-myc公司淋巴瘤细胞突变，我们的研究结果表明c-Myc激活是癌症中Fbw7缺失的关键致癌后果之一。由于Fbw7介导细胞周期蛋白E、Notch和c-Jun以及c-Myc的降解，因此在肿瘤发生过程中，Fbw7的丢失可能会对细胞增殖产生深远影响。
C类Myc家族转录因子水平的改变深刻影响细胞的生长、增殖、分化和凋亡。细胞进化出多种机制来严格控制c水平-myc公司基因产品，包括myc公司转录因子结合启动子，RNA聚合酶延伸减弱，c-myc公司mRNA转运、稳定性和翻译以及c-Myc蛋白的稳定性。c-Myc是一种快速降解的蛋白质(1)大量研究表明泛素途径参与c-Myc降解(2-7).
c-Myc突变分析表明c-Myc反式激活域（TAD）参与泛素化和降解(4，8). TAD跨越40-150个氨基酸，包含序列PTPPLSP（人类c-Myc中的残基57-63），其中T58和S62都被磷酸化(9-11). Ras/MEK/ERK激酶途径介导的S62磷酸化与c-Myc的稳定和积累有关(6，7). S62的磷酸化似乎通过磷脂酰肌醇3-激酶/AKT/糖原合成酶激酶3（GSK-3）级联信号T58随后的磷酸化，触发c-Myc的不稳定。最近的研究表明，S62脱磷酸化也需要进行降解，这是由Pin1脯氨酰异构酶和蛋白磷酸酶2A调节的(12). 此外，T58区域是人类淋巴瘤细胞中c-Myc突变数量最多的区域(13-15). 虽然这些突变的确切生物学效应存在争议，但与淋巴瘤相关的T58突变增加了c-Myc蛋白半衰期，逆转录病毒v-myc公司等位基因(4，16-18).
最近的两篇论文表明F-box蛋白Skp2与c-Myc周转有关体内(19，20). F-box蛋白是SCF的底物识别成分(S公司千帕-C类乌林-F类-盒）泛素连接酶，将蛋白质底物与泛素机械的催化核心结合在一起。重要的是，Skp2对c-Myc的调节既不涉及c-Myc磷酸化也不涉及T58区域，除Skp2外的连接酶必须介导T58依赖的c-Myc蛋白水解。
有证据表明果蝇myc(dmyc公司)和群岛(以前)泛素连接酶(21)我们重点研究了Fbw7/hCdc4的可能参与，它是以前，以c-Myc营业额计算。Fbw7中保留的WD40重复序列介导磷酸化底物的识别(22，23)，和Fbw7靶向磷酸化的细胞周期蛋白E、Notch和c-Jun进行蛋白水解。此外，Fbw7在乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌和结肠癌细胞或细胞系中发生突变，并作为肿瘤抑制因子发挥作用，其缺失会导致遗传不稳定(24-28). 小鼠Fbw7基因缺失导致胚胎死亡，心血管发育缺陷，胚胎和胎盘中细胞周期蛋白E和Notch蛋白增加(29，30). 在这里，我们表明Fbw7与c-Myc相互作用，并调节其在哺乳动物细胞中的蛋白酶体依赖性降解及其泛素化在体外.
方法
抗体和质粒。使用以下抗体：FLAG和微管蛋白（Sigma）；Myc-N262、9E10、Myc-C33、CDK2（M2）、Hsp90和β-catenin（圣克鲁斯生物技术）；pT58 c-Myc（编号9401）（细胞信号）；血凝素（12CA5）；和GSK-3（368662）（钙生物化学）。从Wi-38 cDNA中克隆Fbw7α、Fbw7-γ、Fbv1和Fbw6到3pX-FLAG-myc-CMV-24表达载体（Sigma）并测序。Fbw7β克隆先前已描述(24). 通过QuikChange方法（Stratagene）产生突变并测序。DnFbw7型西部数据由PCR从公共区域的第194个残基开始产生。PGID5-6CS2MT和PGID5-6 LP质粒由F.Zhang和P.Klein（费城宾夕法尼亚大学）提供。为了进行逆转录病毒表达，将FLAG标记的Fbw7克隆到pBabePuro中(31). 如前所述实现RNA干扰(32)目标序列为：Fbw7，ACCTCTGGAGAGAAATGC(24)[Fbw7-1短干扰RNA（siRNA）]或GTGTGGAATGCAGACTGGAGA（Fbw7-2 siRNA），并控制siRNA，TATGCAAGTTTA(33).
细胞培养、瞬时转染、逆转录病毒转导、转录检测和免疫印迹。293、U2OS、HeLa和原代人包皮成纤维细胞（HFF）在含有10%FCS的DMEM中生长。如图所示，用MG-132（5μg/ml，钙生物化学）或LiCl（20 mM）处理细胞。对于Fbw7-介导的转化，用磷酸钙法将1μg pCS2c-Myc质粒与0.3μg pFLAG-Fbw7α或3μg pFLAG-Fbw7β或pFLAG-Fbw7γ质粒共转染(34). 如所述对细胞进行裂解、定量、电泳和Western印迹，IP Western分析如所述(34). 在Phoenix Ampho或Phoenix Eco细胞中制备病毒库（由加利福尼亚州斯坦福大学G.Nolan提供）。细胞由DMEM和5 mg/ml Polybrene中的上清液转导，并用嘌呤霉素（1-3μg/ml）进行筛选。如前所述进行转录分析(35)，使用pGLm2（Ebox-Luciferase）报告载体。将指定量的pCS2+Fbw7单独或与c-Myc（75 ng）和Max（100 ng）一起转染到293T细胞中。
RNA分析。对于RT-PCR，从转导细胞中分离出总RNA，在20μl反转录反应中使用5μg总RNA，并使用2.5μl产生的cDNA进行PCR。Fbw7引物和PCR条件如所述(36). 对照人次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）引物为GAACGTCTTGCTCGGTGT和CTGCATTGTGCCAGTGT。TaqMan分析是通过使用Fbw7引物探针集（可根据要求提供）和ABI Prism 7700序列检测系统（Applied Biosystems），使用TaqMan2×主混合（Perkin-Elmer）和人类甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物（Invitrogen），共三份进行的。
脉冲追逐实验。如所示用1μg CMV-c-Myc和3μg pFLAGFbw7或载体转染293细胞。将平板预孵育（在不含蛋氨酸和半胱氨酸的DMEM中15分钟，外加5%透析的FCS），用Tran脉冲35S标记（ICN；300μCi/ml；1μCi=37 kBq）10分钟，并按指示追赶（DMEM/10%FBS加400 mg/L甲硫氨酸）。如所示，用500μCi/ml Tran标记HeLa细胞35S标记10分钟。用抗c-Myc-N262抗体免疫沉淀裂解液。在环己酰亚胺追踪实验中，293个细胞被FuGENE 6（罗氏分子生物化学）转染5μg dnFbw7西部数据和环己酰亚胺（10μg/ml）处理，如图所示。
Fbw7负调节c-Myc的丰度和功能。(A类)如图所示，用c-Myc（2-8道）和FLAG-Fbw7载体共同转染293个细胞。对裂解液进行c-Myc（c-33）或Fbw7（FLAG）免疫印迹；星号表示背景带。(B类)如图所示，用c-Myc、Max和FLAG-Fbw7共同转染293个细胞。对裂解液进行c-Myc-N262或Fbw7（FLAG）的印迹。(C类)如图所示，用c-Myc和Fbw7转染293细胞，并对Fbw8（FLAG）和c-Myc-N262的表达进行印迹。MG表示用MG-132处理2小时（+）或未处理对照（-）的细胞。(D类)对转染c-Myc和Fbw7γ或空载体的293个细胞进行脉冲相分析（参见方法). 1号通道，未转染细胞。(E类)如图所示，用c-Myc报告质粒c-Myc和Fbw7γ共同转染细胞。显示转录激活（见正文）。
Fbw7对c-Myc的调节需要GSK-3活性和c-Myc T58。(A类)c-Myc T58与cyclin E T380和Cdc4膦解酮（CPD）的序列比对<KR>表示碱性残留物的不利位置。(B类)如图所示转染293个细胞，并对c-Myc-N262和Fbw7（FLAG）进行印迹。(C类)293个细胞与指定的c-Myc构建物和dnFbw7共转染西部数据或向量。显示Fbw7和c-Myc在抗FLAG免疫沉淀物和总裂解物中的丰度。(D类)体外翻译的Fbw7或Fbw6在未磷酸化或T58、S62或两者磷酸化时与固定化c-Myc肽（残基51-69）结合。(E类)用c-Myc（2-6道）和Fbw7γ转染293细胞。用axin GSK相互作用域（GID）或非活性GID突变体（GID*). 第6通道的细胞用氯化锂处理。
肽结合。五微升在体外翻译后的Fbw7或Fbw6与含有残基51-69的固定化c-Myc肽（KKFELLPTPPLSPSRRSGL）或T58、S62或两者上磷酸化的相同肽在0.15 ml 50 mM Tris·HCl/2 mM EDTA/100 mM NaCl/0.1%Nonide P-40中培养1 h，然后用结合缓冲液洗涤三次。用20%的输入作为对照，对结合蛋白进行SDS/PAGE和放射自显影。
体外试验无所不在。Myc泛素化通过使用在体外[35S] 在Erk2（25单位，新英格兰生物实验室）、昆虫细胞衍生的GSK-3β（100 ng）、E1泛素激活酶（50 ng）、Ubc5（200 ng）、泛素（1 mg/ml）、，1μM泛素醛，2.3μl在体外翻译的FLAG标记的F-box蛋白，以及总体积为10μl（60分钟，30°C）的4mM ATP。
结果
Fbw7消极调节c-Myc的周转和功能。Fbw7基因编码由选择性剪接mRNA产生的三种蛋白质亚型(24-26). 我们发现，每种亚型与c-Myc共转染都大大降低了c-Myc的表达，而缺乏F-box（ΔF）的非功能Fbw7突变体则没有(). 癌症相关的Fbw7失活突变（R298H，来自第一个共享外显子的298个残基）也严重削弱了Fbw7-介导的c-Myc消除(). 当c-Myc结合伙伴Max被包括在内时，Fbw7消除了c-Myc，但没有改变Max丰度（数据未显示）。Fbw7还以类似于c-Myc的方式消除了N-Myc的表达（未显示）。
接下来，我们询问Fbw7驱动的c-Myc转换是否依赖于蛋白酶体，并发现Fbw6消除c-Myc的作用被蛋白酶体抑制剂MG-132逆转(). 为了证实c-Myc丰度降低是由于c-Myc蛋白水解增加所致，我们通过脉冲相分析测量了c-Myc半衰期，发现Fbw7γ与c-Myc共转染将c-Myc的半衰期从≈30分钟缩短到13分钟(). 总之，这些数据表明Fbw7促进c-Myc的周转，这需要完整的蛋白酶体和Fbw8功能。
与其致癌基因的作用一致(37，38)，Skp2表达增加c-Myc转录活性(19，20). 因为Fbw7是一种肿瘤抑制因子，我们预测它应该抑制c-Myc活性。因此，我们通过使用已建立的c-Myc报告子分析来确定Fbw7表达对c-Myc转录激活的影响(35). 我们发现，与Skp2相比，Fbw7共表达以剂量依赖的方式抑制c-Myc转录活性().
Fbw7和c-Myc的物理相互作用。确定Fbw7和c-Myc是否关联体内，我们从表达Myc和/或Fbw7的细胞裂解液中免疫沉淀c-Myc或Fbw7(和数据未显示）。当蛋白酶体抑制阻止c-Myc周转时，c-Myc和Fbw7有效地共沉淀(，比较车道3和7）。相反，另外两种也含有WD40重复序列的F-box蛋白（Fbw1/β-TRCP和Fbw6）既不与c-Myc结合也不被消除(). 我们通过开发表达低水平Fbw7α或Fbw6γ的逆转录病毒载体，确定内源性c-Myc是否与Fbw8的近生理水平结合，从而扩展了这些发现。Fbw7α和Fbw7-γ均与内源性c-Myc共沉淀，在每种情况下，结合对蛋白酶体抑制敏感(). 这些数据表明c-Myc和Fbw7特异性相互作用，并表现出对蛋白酶体功能敏感的稳定结合。
Fbw7和c-Myc的物理相互作用对蛋白酶体功能敏感。(A类)293个细胞按指示转染；vec，仅矢量。上两种凝胶，裂解物中的c-Myc和F-box蛋白丰度。下两个凝胶，c-Myc和F-box蛋白在抗F-box蛋白（抗FLAG）免疫沉淀物（IP）中的丰度。显示MG-132处理。(B类)如图所示，用表达FLAG-Fbw7α或FLAG-Fbw7γ的逆转录病毒转导HeLa细胞，并用MG-132处理，显示裂解物和抗Fbw8（FLAG）免疫沉淀物中内源性c-Myc和Fbw7-丰度。星号表示背景带。
Fbw7-催化的c-Myc周转需要c-Myc苏氨酸-58和GSK-3。 显示了细胞周期蛋白E T380区域[高亲和力Fbw7结合位点(24，26，33)]以及c-Myc T58区域。这些区域之间存在显著的同源性，c-Myc T58完全符合Cdc4的高亲和力共有磷酸结合基序，称为Cdc4磷酸化降解子或CPD(22). 如c-Myc T58(7，10，39，40)，细胞周期蛋白E T380也被GSK-3磷酸化(33)，表明细胞周期蛋白E和c-Myc含有同源的Fbw7-结合基序，这些基序受共享的有丝分裂信号转导途径调节。
我们研究了T58在Fbw7-驱动的c-Myc周转中的作用，发现Fbw7并没有降低共转染c-MycT58A的丰度（其中T58被转变为丙氨酸，). S62或T58和S62突变也阻止Fbw7-介导的c-Myc消除(，将车道4和5与车道8和9进行比较）。然而，因为T58磷酸化需要S62磷酸化，所以我们无法区分S62磷酸的影响本身S62A突变体中T58磷酸化缺陷。
通过两种方法测试Fbw7结合中c-MycT58磷酸化的需求。我们首先用dnFbw7共同转染c-Myc或c-MycT58A西部数据，一种只包含WD40重复序列的显性阴性Fbw7突变体(41)发现WT c-Myc与dnFbw7有效共沉淀西部数据，c-MycT58A没有(). 我们在这些实验中使用了非活性Fbw7来分离结合和周转。T58到S58的转换恢复了Fbw7结合，尽管它减少了(，车道4和8），与报告一致(22)cyclin E CPD通过磷酸苏氨酸比磷酸丝氨酸更有效地与Cdc4相互作用。最后，我们发现dnFbw7的能力西部数据稳定c-Myc与结合密切相关，并且通过dnFbw7增加WT c-Myc和c-MycT58S水平西部数据但c-MycT58A不是( 底部).
我们还使用与c-Myc CPD对应的合成肽来进一步确定T58磷酸化在介导Fbw7结合中的作用。这些肽与Fbw7的结合强烈依赖于T58磷酸化(). 有趣的是，尽管Ras介导的S62磷酸化阻止了c-Myc的转换体内(7)，我们发现T58S62双磷酸化肽仍然与Fbw7结合，这表明S62稳定的机制不可能涉及抑制Fbw8结合。相反，Fbw6蛋白与c-Myc肽没有磷酸化依赖性结合。这些数据表明，T58磷酸化调节Fbw7与c-Myc CPD的物理相互作用，并且是Fbw7-驱动的c-Myc周转所必需的。
有大量证据表明，GSK-3调节c-Myc稳定性，是主要的c-Myc T58激酶(7，39). 为了测试内源性GSK-3在Fbw7介导的c-Myc转换中的作用，我们通过过度表达与结合并抑制GSK-3的axin GSK-3相互作用域（GID）对应的肽来抑制GSK-2(42)（图3E类，比较泳道3和4，以及图6，该图发布为支持信息在PNAS网站上），并通过锂（一种药理性GSK-3抑制剂）治疗(，比较车道3和6）。在这两种情况下，我们发现GSK-3抑制阻止Fbw7-驱动的c-Myc消除。相比之下，带有点突变的控制GID肽阻止GSK-3相互作用并不能阻止c-Myc的转换(，车道5）。这些数据表明，Fbw7-驱动的c-Myc周转需要内源性GSK-3活性，并强烈支持Fbw7-2驱动的c-Myc周转要求GSK-3在T58上磷酸化c-Myc的模型。
内源性Fbw7对内源性c-Myc的调节。我们开发了逆转录病毒载体，通过稳定表达靶向Fbw7共同区域的siRNA来抑制Fbw7。由于无法获得识别内源性Fbw7的抗体，我们通过使用内源性Fbw7 mRNA的半定量PCR和定量实时PCR分析证明siRNA降低了逆转录病毒或转染的FLAG标记的Fbw7的表达，从而证实了Fbw7 siRNA的功效（图7，发表于支持信息在PNAS网站上，数据未显示）。siRNA导致Fbw7表达减少50%或更多，我们发现，在细胞培养过程中，siRNA对Fbw8的稳定敲除被快速选中（数据未显示）。Fbw7 siRNA增加U2OS细胞和原代人成纤维细胞内源性c-Myc的丰度( 左侧和居中). 为了控制可能的siRNA对Fbw7以外基因的影响，我们开发了额外的Fbw7common region siRNA（siFbw7-2），这也增加了内源性c-Myc的丰度( 赖特)脉冲相位分析中的延迟c-Myc转换(). 相反，一些控制蛋白不受Fbw7 siRNA的影响().
内源性c-Myc丰度由内源性Fbw7调节。(A类)用编码控制（C）siRNA或两种不同Fbw7 siRNA的逆转录病毒载体（U2OS和HFF细胞，Fbw7-1 siRNA；HeLa细胞，Fbw7-2 siRNA）转导U2OS细胞、HFF和HeLa电池。对裂解液进行c-Myc、微管蛋白、GSK-3、Cdk2和Hsp90的印迹。(B类)用si-Fbw7-2或对照逆转录病毒转导的HeLa细胞内源性c-Myc稳定性的脉冲相分析。(C类)293个细胞转染了越来越多的dnFbw7西部数据并显示内源性c-Myc蛋白的量。(D类)用载体或dnFbw7转染293个细胞西部数据用环己酰亚胺（CHX）处理指定时间（min）后，分析裂解产物的总c-Myc（9E10）或pT58-c-Myc（p-Myc）蛋白。
通过用dnFbw7抑制内源性Fbw8活性，进一步研究了内源性Fbw7对内源性c-Myc周转的作用西部数据.dn-机身7西部数据在环己酰亚胺和代谢脉冲相分析的存在下，c-Myc的表达增加了c-Myc丰度并延迟了内源性c-Myc周转(和数据未显示）。dnFbw7的影响西部数据用特异性磷酸化T58抗体（p-Myc，). dnFbw7延迟了pT58-c-Myc的周转西部数据甚至比总c-Myc周转量更大，表明T58-磷酸化c-Myc构成对dnFbw7最敏感的c-Myc总量的一部分西部数据.
重要的是，siRNA或dnFbw7抑制Fbw7西部数据延迟但不取消c-Myc营业额。这一发现与在T58上无法磷酸化c-Myc时观察到的结果非常相似。也就是说，c-MycT58A比WT c-Myc更稳定，但仍然不稳定，这表明T58和Fbw7-独立机制也能降解c-Myc(4，7，17，39). 总之，siRNA和dnFbw7西部数据这些方法表明，内源性Fbw7调节内源性c-Myc的丰度和周转。
Fbw7促进c-Myc泛素化体外.因为我们的数据预测Fbw7能够招募SCF到c-Myc并促进其泛素化，所以我们确定SCF是否飞行重量7可以直接刺激c-Myc泛素化在体外.体外-翻译的c-Myc或c-MycT58A与含有Fbw7或Fbw2的网织红细胞提取物以及其他必需的泛素化成分（包括作为E2酶的UbcH5）一起培养。我们将外源性GSK-3添加到这些反应中，因为我们发现c-Myc在这些提取物中未被T58磷酸化，但GSK-3大大刺激了T58磷酸化合（图8，发表于支持信息在PNAS网站上）。Fbw7特异性地将WT c-Myc转化为更高分子量的产物，但Fbw2没有(). 此外，这种转换需要T58和GSK。当我们使用小麦胚芽提取物代替网织红细胞提取物作为c-Myc的来源时，也得到了类似的结果(). 与针对c-Myc的多种泛素化途径一致，我们发现少量的背景活性取决于网织红细胞提取物的数量，而不是T58磷酸化。因此，Fbw7以T58-和GSK-3依赖的方式直接催化c-Myc泛素化。
Fbw7催化磷酸化依赖的c-Myc泛素化在体外.(A类)翻译了c-Myc或c-MycT58A在体外在GSK-3存在下使用网织红细胞提取物在体外泛素化反应（见正文）。如图所示，添加含有Fbw7的网织红细胞提取物。(B类)体外如上所述，网织红细胞提取物中c-Myc的泛素化，但如图所示添加了GSK-3和Erk，并且所有样品都含有Fbw7。(C类)如图所示，在含有Fbw2或Fbw7的小麦胚芽提取物中翻译c-Myc或c-MycT58A，并且在体外进行泛素化反应。
讨论
我们已经证明Fbw7调节磷酸化依赖的c-Myc降解。此前已发现Fbw7在CPD内磷酸化后促进细胞周期蛋白E的降解(24-26，33). 我们现在证明，c-Myc蛋白在与细胞周期蛋白E CPD高度相关的结构域内磷酸化后，也被Fbw7降解。当Fbw7过度表达时，c-Myc转换增加，Fbw7-介导的c-Myc降解受到Fbw7F-box或β-推进器区域突变或药物蛋白酶体抑制的损害。通过靶向Fbw7的siRNA以及采用dnFbw7.的平行方法研究内源性Fbw7-在内源性c-Myc蛋白降解中的作用。这些实验证实，无论哪种方法，内源性Fbw7抑制都会增加c-Myc的丰度并延缓c-Myc周转。因此，Fbw7过度表达或抑制分别导致c-Myc丰度减少或增加。我们还发现c-Myc与Fbw7特异性相互作用，这是由蛋白酶体功能调节的。这些数据与莫伯格的工作吻合得很好等。(21)，谁报告了之前果蝇属Fbw7的同源基因结合dMyc并调节其丰度和细胞生长功能。
c-Myc T58区域先前被确定为依赖于GSK-3磷酸化T58的c-Myc降解的关键信号(4，7，10，40). 我们的数据表明(我)Fbw7-介导的Myc降解需要T58和内源性GSK-3活性体内; (ii（ii）)T58磷酸化调节Fbw7与c-Myc CPD的结合；和(三)Fbw7直接促进c-Myc泛素化在体外，并且这需要T58和GSK-3两者。总之，这些数据表明Fbw7介导T58磷酸化依赖的c-Myc转换。
两种不同的SCF受体蛋白结合c-Myc并促进其降解，这表明c-Myc功能的不同方面受到调节。Skp2结合c-Myc的碱性螺旋环-螺旋亮氨酸拉链（bHLHZ）和Myc盒II（MBII）区域(19，20). 这两个区域都对Myc转录活性至关重要，这与短命转录因子的泛素化与其转录活性紧密耦合的模型一致(43). 然而，Skp2不太可能是c-Myc稳定性的唯一调节器。与大多数专门识别磷酸化底物的SCF复合物不同，Skp2与缺乏已知磷酸化位点的c-Myc结构域结合，并且Skp2-介导的c-Myc转换是磷酸化独立的(19，20). 因此Skp2不能调节T58依赖性c-Myc的周转。
与Skp2相反，Fbw7介导的c-Myc转换需要经典CPD中的T58磷酸化。GSK-3的T58磷酸化在有丝分裂反应中调节c-Myc的稳定性(6，7，10，39). 此外，Skp2增加c-Myc转录活性(19，20)我们在这里表明，Fbw7起到了降低其活性的作用。这些对c-Myc转录活性的相反作用与Skp2作为显性癌基因发挥作用的观察结果一致，但Fbw6作为隐性肿瘤抑制基因发挥作用。因此，SCF很可能细胞S期激酶相关蛋白2和SCF飞行重量7这些途径在c-Myc调控方面发挥着非常不同的功能。我们推测，在c-Myc磷酸化受GSK-3和Ras调节的情况下，Skp2促进c-Myc的转换与其转录激活一致，而Fbw7负调控c-Myc。
这个fbw7型该基因发现于4q32内，4q32是一个在许多人类癌症中发生突变的染色体区域，并且癌细胞中已记录的Fbw7突变支持其被鉴定为人类肿瘤抑制因子(25-27). c-Myc和cyclin E都是Fbw7底物的观察结果可能反映了这些蛋白在正常细胞中的协同调节。事实上，细胞周期蛋白E和c-Myc在静止细胞中均不存在，并且在有丝分裂刺激后呈周期性表达。此外，细胞周期蛋白E和c-Myc在其CPD基序中均被GSK-3磷酸化，当GSK-3被抑制时，这两种蛋白都对Fbw7驱动的转换产生抵抗(33). 因此，c-Myc和cyclin E是细胞生长和分裂的关键调节器，在调节其表达的信号转导和蛋白水解途径中共享元素。此外，Fbw7调节Notch和c-Jun丰度(41，44). 因此，破坏Fbw7的癌相关突变有望在单个突变中解除对cyclin E、c-Myc、c-Jun和Notch信号的调控，而癌症中的Fbw8缺失可能同时解除对调节细胞分裂、细胞生长、凋亡和细胞分化的途径的调控。总之，Fbw7是进化上保守的通路的一部分，允许对细胞外信号进行c-Myc的磷酸化依赖性控制。
致谢
我们感谢Ken Moberg和Iswar Hariharan提供的预发布信息，感谢Lee Madrid和Carla Grandori提供的建议和试剂，感谢Jherek Swanger和Jason Yada提供的技术帮助。这项工作得到了国家癌症研究所拨款R01CA84069、R01CA102742-01（B.E.C.）和R01CA20525（R.N.E）、国家卫生研究院拨款AG11085（J.W.H.）、白血病和淋巴瘤学会（M.W.）、人类前沿科学计划（A.O.）和国防部（J.J.）的支持。B.E.C.是W.M.Keck杰出青年学者，R.N.E.是美国癌症学会研究教授。
注意事项
缩写：GSK-3，糖原合成酶激酶3；SCF，Skp-Cullin-F-box；siRNA，短干扰RNA；CPD，Cdc4膦化试剂；GID、GSK交互域。
参见评论第8843页.
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