类氢化酶Nar1p对细胞溶质和核铁硫蛋白的成熟至关重要

摘要

介绍

氢化酶是产生或代谢分子氢的酶(彼得斯，1999年;维尼（Vignais）等, 2001;霍纳等, 2002). 它们通常根据金属含量分为两大类。第一组含有铁作为唯一的金属（铁氢化酶），而第二组含有镍加铁，有时还含有额外的硒（NiFe和NiFeSe氢化酶。氢化酶不仅存在于古生菌和细菌中，也存在于一些真核生物中，如绿藻和原生动物。令人惊讶的是，几乎在所有真核生物中都发现了一组铁氢化酶的密切同源物，包括那些不知道会产生或消耗氢的生物，如酵母和人类(霍纳等, 2002). 这些蛋白质定义了一个家族，包括酿酒酵母Nar1p和人类Narf，它们的总氨基酸同源性为25-30%（根据化学相似性为40-50%；图1). Nar1p-like蛋白的序列相似性延伸到铁氢化酶的约470个C末端残基，如脱硫弧菌HydA公司(尼科莱特等, 1999)或梭菌CpI(彼得斯等, 1998).

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图1

类Nar1p蛋白和铁氢化酶的序列比对。Nar1p-like蛋白的多序列比对，脱硫弧菌使用Multalin程序执行HydA和HydC以及梭状芽孢杆菌CpI氢化酶(Corpet，1988年). 保守的半胱氨酸残基以黄色和青色突出显示（氢化酶特异）。指示了铁氢化酶中与H簇配合的半胱氨酸残基（H）。生物体缩写：Sc，酿酒酵母; 服务提供商，葡萄裂殖酵母; Hs、，智人; 嗯，小家鼠; 在，拟南芥; 内容提供商；巴氏梭菌; 数字电视；普通脱硫弧菌.

在其N末端，Nar1p携带一个含四个保守半胱氨酸残基的类铁氧还蛋白结构域，可以结合[4Fe–4S]簇。Nar1p的C末端部分还含有四个保守的半胱氨酸残基，在纯铁氢化酶中，这些残基具有一个独特的H簇。该部分由两个子簇组成，一个立方[4Fe–4S]簇和一个由半胱氨酸硫桥接的双核[2Fe]中心。簇合物形成了铁氢化酶的催化中心(尼科莱特等, 2000). 分子模拟表明，在Nar1p类序列中，含铁氢化酶H簇的空腔只有一侧是保守的，这表明Nar1p及其同源物具有不同的功能作用(尼科莱特等, 2002). 然而，到目前为止，Nar1p-like蛋白的细胞任务尚不清楚。到目前为止，仅对Nar1p蛋白家族的一个成员，即人类核蛋白Narf进行了研究。该蛋白与细胞核中的戊二醛化前胺A特异结合(巴顿和沃曼，1999年). 然而，这种相互作用的功能意义尚不清楚，特别是因为Narf也存在于不表达层粘连蛋白A的细胞中酿酒酵母不含任何层粘连蛋白同源物，Nar1p在核层粘连组装中的功能似乎不太可能。值得注意的是，人类基因组编码了Nar1p的第二个同源物，称为Hprn，该同源物与Nar1p具有显著更高的相似性，因此更可能代表Nar1b的功能同源物。

我们对Nar1p作为一种潜在的核Fe/S蛋白感兴趣，因为迄今为止还不清楚核Fe/S-簇合物的组装。相比之下，在过去几年中，我们对线粒体和细胞溶质Fe/S蛋白的生物生成的认识有了很大提高。真核生物中铁/硫簇的生物合成发生在线粒体中，由位于线粒体基质中的至少10种蛋白质组成的复杂机制介导，这些蛋白质来源于线粒体的细菌祖先（有关综述，请参阅里尔和基斯帕，2000年;Craig和Marszalek，2002年;Gerber和Lill，2002年;Frazzon和Dean，2003年). 所谓铁硫簇（ISC）组装机制的核心参与者是磷酸吡哆醇依赖性半胱氨酸脱硫酶Nfs1p，它为支架蛋白Isu1p/Isu2p上的Fe/S簇合成提供硫。电子通过由[2Fe–2S]铁氧化还原蛋白Yah1p和铁氧化还原酶Arh1p组成的电子转移链还原未知底物(穆伦霍夫等, 2003).

线粒体ISC组装机械也是细胞溶质Fe/S蛋白成熟所必需的(基斯帕语等, 1999;兰格等, 2000). 迄今为止，已经确定了三种成分，它们是细胞溶质成熟所需的，而不是线粒体Fe/S蛋白的成熟所需，即线粒体内膜的ABC转运蛋白Atm1p、膜间空间蛋白Erv1p和三肽谷胱甘肽(基斯帕语等, 1999;兰格等, 2001;西波斯等, 2002). 目前的模型表明，ABC转运体将ISC组装机产生的化合物输出到细胞液中，以在胞质载脂蛋白上形成Fe/S簇。对于后一个过程知之甚少，但最近有一种酵母突变称为cfd1型描述了细胞溶质Fe/S簇组装缺陷，但线粒体Fe/S蛋白没有缺陷。这个CFD1公司该基因编码细胞溶质P-loop ATP酶，但其确切功能尚不清楚(罗伊等, 2003). 一种称为ApbC的同源蛋白已被证明是体内Fe/S簇依赖性代谢所必需的肠道沙门菌(Skovran和Downs，2003年). 此外，固氮酶-铁蛋白NifH，一种遥远的Cfd1p同源物，也参与FeMo辅因子的生物合成和插入固氮酶-铁蛋白(罗宾逊等, 1987). 总之，这些观察结果表明P-loop ATP酶在Fe/S簇组装中起着重要作用。

在本报告中，我们表明酵母Nar1p是一种必需的Fe/S蛋白，位于胞浆中，其中一部分与细胞膜相关。Nar1p上的Fe/S簇组装依赖于线粒体ISC机制。令人惊讶的是，可调控酵母突变体中Nar1p的缺失导致细胞溶质上的Fe/S簇组装严重缺陷，而线粒体Fe/S蛋白上没有。此外，核Fe/S蛋白的成熟需要Nar1p。因此，我们的研究首次定义了类氢化酶Nar1p及其真核同源物在线粒体外Fe/S蛋白生物合成中的功能。

结果

Nar1p是一种铁/硫蛋白

真核生物Nar1p-like蛋白与细菌氢化酶的相似性表明Nar1p是一种含有两个Fe/S假体基团的Fe/S蛋白(霍纳等, 2002;尼科莱特等, 2002). 为了对此进行调查斯特雷普-标记蛋白在大肠杆菌并通过斯特雷普-他汀亲和层析。分离出的重组Nar1p呈黄棕色，可见吸收光谱在420 nm左右显示出宽的无结构“肩部”(图2A)[4Fe–4S]的典型值²⁺[2Fe–2S]通常没有发现集群和结构化特征²⁺集群(Orme-Johnson和Orme-约翰逊，1982年). 用1mM连二亚硫酸钠还原后，可见范围内的吸光度发生部分漂白。

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图2

纯化Nar1p的光谱分析。(A类)的吸收光谱斯特雷普-将Nar1p（1.6μM）标记为已分离，并在含有40μM脱硫生物素的缓冲液TNE（100 mM Tris–HCl，pH 8，150 mM NaCl，1 mM EDTA）中用1 mM连二亚硫酸钠还原后。(B类)在以下条件下记录重组Nar1p的EPR谱：微波频率9.460±0.001GHz；调制频率，100 kHz；调制幅度1.25 mT.（a）Nar1p（50μM）在缓冲液TNE中用5 mM连二亚硫酸钠和1 mM脱硫生物素（0.80 mW，10 K）降低。（b） 如（a）所示，但在200 mW，10 K下记录。（c）通过从a中减去适当的谱强度b而获得的尖锐菱形EPR信号。（d）谱c的理论模拟(Beinert和Albracht，1982年). 模拟参数，克_z（z）=2.022,克_年=1.926和克_x个=1.823; 线宽分别为2.5、3.0和3.1mT。为了进行比较，添加了微量（e–h），并对Nar1p实验的微波频率进行了适当的磁场校正。（e） [2Fe–2S]¹⁺还原菠菜叶铁氧还蛋白的聚类(Hagen和Albracht，1982年). （f） [4Fe–4S]¹⁺部分连二亚硫酸钠诱导的异二硫还原酶中的簇马尔堡甲烷热杆菌（9.459 GHz，20 mW，30 K；由R Hedderich博士（马尔堡陆地微生物学MPI）提供。（g） 两个相互作用的[4Fe–4S]¹⁺全还原铁氧还蛋白中的簇发酵酸氨球菌（9.65 GHz，2 mW，12 K；塔默等, 2003). （h） 硫堇处理后的氧化h团簇巴氏杆菌铁氢化酶CpI（9.23 GHz，10 mW，20 K；亚当斯，1987).

为了进一步证实重组Nar1p中存在Fe/S团簇，进行了低温电子顺磁共振（EPR）光谱。连二亚硫酸钠还原样品发出菱形EPR信号克的值克_z（z）=2.022,克_年=1.926和克_x个=1.823 (图2B，跟踪a）。与特征良好的Fe/S蛋白簇相比，EPR信号不典型。例如克数值和线型并不反映典型的[4Fe–4S]¹⁺并不符合[2Fe-2S]¹⁺簇（参见。图2B; 记录道e–g）。此外，该信号与报道的铁氢化酶H簇的信号不同（痕量H）。值得注意的是，H团簇仅以氧化形式具有EPR活性(皮尔里克等, 1992)而Nar1p是氧化（隔离）形式的EPR-silent，需要还原才能生成EPR信号。EPR信号在30 K以上消失（未显示）。这个发现和吸收光谱(图2A)表明Nar1p不含[2Fe–2S]簇(Orme-Johnson和Orme-约翰逊，1982年; 也见下文）。在较高功率下，菱形EPR信号饱和(P（P）_1/2=5 mW），一个潜在的广泛信号变得明显（痕迹b）。通过从迹线a（迹线c）中减去宽信号获得的菱形信号的光谱贡献可以在理论上模拟（迹线d），并与实验光谱精确匹配(Beinert和Albracht，1982年).

磁耦合Fe/S团簇具有典型的宽EPR信号。在细菌铁氧还蛋白和铁氢化酶中，有两种[4Fe–4S]¹⁺已知距离为1–1.5 nm的团簇会产生广泛的磁耦合EPR光谱，这不仅仅是两个单独[4Fe–4S]的总和¹⁺集群(图2B，迹线g；马修斯等, 1974). 因此，我们认为Nar1p的宽的、无特征的EPR信号是由菱形EPR信号和另一个处于完全还原状态的团簇之间的磁相互作用产生的。使用5′-脱氮黄素进行光还原时观察到的宽信号支持了这一解释，这导致Nar1p完全还原（未显示）。观测到的平均值克耦合谱值（1.91；图2B，迹线b）是从平均值建立的克耦合伙伴的值（计算为1.90）和菱形信号的值（1.92；迹线a）。因此，耦合伙伴很可能也代表Fe/S团簇，这一想法与可见吸收光谱一致(图2A)Nar1p-like蛋白中的8个保守半胱氨酸残基(图1).

化学分析斯特雷普-在厌氧条件下纯化的标记蛋白显示，每个蛋白中存在3.5±0.2个非血红素铁原子和2.9±0.1个酸性硫原子。Nar1p中的铁和硫含量低于EPR检测到的两个团簇的预期。我们假设在生产过剩期间大肠杆菌只有一部分Nar1p转化为Fe/S全蛋白。早期对固氮酶的研究表明，多个Fe/S簇可以完全或根本不整合到脱辅蛋白中(史密斯等, 1980). 总之，我们的初步光谱特征表明Nar1p是一种复杂的Fe/S蛋白质。最有可能的是，它包含两个耦合的Fe/S团簇，其中一个是不寻常的Fe-S团簇。

耗尽Nar1p会导致生长停滞，而人类Nar1p同源物的表达无法恢复生长停滞

为了启动Nar1p的功能研究，我们构建了一个可调控的突变体NAR1公司为此NAR1公司起始密码子被替换为GAL1-10型启动子通过同源重组产生菌株Gal-NAR1。当Gal-NAR1细胞在含有半乳糖的培养基中生长时，Nar1p的生成水平高于野生型细胞(图3A)，但细胞生长未受影响(图3B). 当葡萄糖作为唯一碳源以耗尽Nar1p时，通过免疫染色在细胞裂解液中无法检测到Nar1p-特异性条带，这证实了我们的抗血清的特异性(图3A). Gal-NAR1细胞在含有葡萄糖的琼脂平板上没有产生菌落(图3B)，表明了这一点NAR1公司对于酵母细胞的生存能力是必不可少的。

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图3

酵母NAR1公司是一种基本基因，不能被其人类同源物取代。(A类)野生型（WT）和Gal-NAR1细胞在添加半乳糖（Gal）的富液培养基中生长，半乳糖是半乳糖和葡萄糖（Ga/Gl）或葡萄糖（Glu）的1:1混合物。使用抗Nar1p抗血清对碱解制备的总细胞提取物进行Nar1p免疫染色。57kDa的次要带可能代表成熟Nar1p的分解产物。(B类)野生型和Gal-NAR1细胞在含有富含半乳糖（YPGal）或葡萄糖（YPD）的培养基的琼脂平板上在30°C下培养2×2天。显示了10倍系列稀释液。(C类)用质粒p416MET25转化Gal-NAR1细胞，该质粒不含插入物（−）、酵母NAR1公司基因，或人类的基因NARF公司和HPRN公司细胞在YPD培养基上生长2×2天，30°C（左）。用半乳糖培养的细胞携带（1）酵母质粒，通过RT-PCR检测人类基因的表达NAR1公司, (2)NARF公司和（3）HPRN公司基因。在没有逆转录酶的情况下进行对照反应。

为了研究人类同源物Narf和Hprn是否能在功能上取代Nar1p，相应的基因在Nar1p-缺失的Gal-NAR1细胞中表达(图3C，右侧面板）。这两个人类基因都不能在含糖培养基上生长时挽救Gal-NAR1细胞的致死表型（左侧面板）。相反，酵母NAR1公司完全恢复了Gal-NAR1突变细胞的生长缺陷，表明这些细胞在这些条件下特异性地缺乏Nar1p。我们得出结论，人类Nar1p样蛋白不能取代酵母中Nar1p的细胞任务。然而，人类基因对缺乏Nar1p的酵母细胞缺乏互补性并不排除这些蛋白质可能在酵母和人类中发挥同源功能。

Nar1p主要定位于胞浆中

Nar1p的亚细胞定位由就地免疫荧光。酵母细胞过度表达NAR1公司用亲和纯化抗体标记，然后用荧光团结合的二级抗体孵育。免疫荧光的分布方式与用抗细胞溶质标志蛋白Pgk1p（磷酸甘油酸激酶）单克隆抗体标记后发现的分布方式类似(图4A). 该信号对过度产生的Nar1p是特异性的，因为在野生型细胞中没有检测到荧光。显然，Nar1p的内源性水平太低，无法通过我们的免疫染色程序进行检测。这一结果与低表达水平的NAR1公司通过我们的免疫印迹分析和系统蛋白表达分析确定的野生型细胞中(图3A;加埃马加米等, 2003).

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图4

Nar1p的亚细胞定位。(A类)现场Nar1p的本地化。用含有NAR1公司或者没有基因。对数期细胞用2.4%（w/v）甲醛固定，渗透并用纯化的抗Nar1p（αNar1p）或单克隆抗Pgk1p（αPgk1p）抗体标记，然后用荧光团偶联的第二抗体（绿色）标记。DNA用DAPI复染，用红色表示NAR1公司插入低拷贝表达载体p416MET25。(B类)细胞组分中Nar1p的免疫印迹分析。对数期野生型细胞转化为球形体（Sph），进行Dounce匀浆，在去除完整细胞和细胞碎片后，通过在12000℃离心10分钟，将提取物分为线粒体后上清液（PMS）和粗线粒体（CM）克对从载体p426-NAR1过度产生Nar1p的细胞进行了类似的分离。使用单独的野生型酵母培养物通过Ficoll梯度离心分离细胞核（Nuc）(阿里斯和布洛贝尔，1991年). 用SDS–PAGE分离等量的蛋白质（20μg/条），对Nar1p或已知细胞定位的标记蛋白进行印迹和免疫染色（左面板；胞浆磷酸甘油酸激酶Pgk1p；线粒体ATP/ADP载体Aac2p；内质网转座子亚基Sec61p；核DNA聚合酶相关Pol30p）。粗线粒体部分在Nycodenz分级颗粒上进一步分离为含有富集线粒体（Mit）和微粒体膜（Mem）的部分。样本通过免疫染色进行分析（右侧面板；Mge1p；线粒体基质）。

由于过度表达偶尔会导致人工制品，我们使用野生型和Nar1p过度生产细胞的亚细胞分离作为Nar1p定位的独立方法。细胞转化为球状体，裂解，离心分离为线粒体后上清液和颗粒组分，组分通过蛋白质印迹分析进行分析。内源性和过量生产的Nar1p表现类似，存在于线粒体后上清液部分（约占总量的80%）以及含有粗线粒体和其他细胞器的颗粒部分中(图4B，左）。在上清液部分中，发现了一条质量较小的条带，根据其免疫反应性和表达模式，该条带是Nar1p的降解产物。即使在存在蛋白酶抑制剂和厌氧条件下执行该程序，也会出现降解（未显示）。显然，Nar1p对蛋白质水解相当敏感。当通过密度梯度离心进一步分离粗线粒体部分时，Nar1p在微粒体膜部分富集(图4B，右侧）。相反，除Nar1p与这些细胞器相关外，纯化线粒体中Nar1p的有效耗竭也得以实现。在Ficoll-纯化的细胞核中，检测到低质量的Nar1p特异性条带，但没有检测到全长Nar1p。这些条带也可能是在漫长的隔离过程中产生的降解产物。综上所述，这些数据表明Nar1p主要定位于胞浆中，部分为膜相关。Nar1p的定位与Cfd1p类似(罗伊等, 2003)，但与人类同源Narf明显不同，Narf被发现完全是核的(Barton和Worman，1999年).

Nar1p的Fe/S簇成熟需要线粒体ISC机制

线粒体ISC组装和输出机制先前被证明是细胞液中Fe/S蛋白成熟所必需的(里尔和基斯帕，2000年). 因此，我们测试了从头开始Nar1p-Fe/S蛋白的成熟取决于线粒体ISC组装和输出途径的成分。我们利用了细胞中的各种线粒体ISC成分，如半胱氨酸脱硫酶Nfs1p、铁氧还蛋白Yah1p和ABC转运蛋白Atm1p，可以通过使用GAL1-10型相应ISC基因上游的启动子(基斯帕语等, 1999;兰格等, 2000). 这些突变细胞和野生型细胞用质粒转化，以过度表达NAR1公司、和在含有半乳糖或葡萄糖的低铁培养基中培养，然后用放射标记⁵⁵铁。细胞溶解后，使用特定的抗Nar1p抗血清从细胞提取物中免疫纯化Nar1p。Nar1p是以这种方式分离的主要蛋白质，银染色证实了这一点（未显示）。Fe/S团簇的组装由⁵⁵用闪烁计数法将Fe掺入Nar1p中(基斯帕语等, 1999). 在野生型细胞或半乳糖培养的Gal-NFS1、Gal-YAH1和Gal-ATM1细胞（即合成相应Isc蛋白的细胞）中，大量的⁵⁵Fe被纳入Nar1p(图5A，左栏）。在没有过度产生Nar1p的细胞中，发现放射性水平低三到五倍(图5A，第三条）。由于内源性Nar1p与免疫球（未显示）没有检测到相关性，因此这些量代表了我们的检测背景。

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图5

Nar1p上的Fe/S簇组装依赖于线粒体ISC机制。(A类)用质粒p426-NAR1（NAR1↑）或空载体p426（−）转化野生型和半乳糖可调节的Gal-NFS1、Gal-YAH1和Gal-ATM1细胞。细胞在添加半乳糖（Gal）或葡萄糖（Glu）的铁盐培养基中生长24小时。细胞用放射标记⁵⁵Fe，并被Triton X-100缓冲液中的玻璃珠打碎。通过免疫沉淀法从细胞提取物中分离出Nar1p⁵⁵通过闪烁计数定量与Nar1p相关的铁。通过细胞提取物的免疫染色显示所示蛋白质。(B类)将过量生产Nar1p的指示细胞培养40 h，并按（A）中所述分析细胞提取物。

在补充葡萄糖的培养基中生长24小时，Nfs1p、Yah1p或Atm1p耗尽后⁵⁵与野生型情况相比，与抗Nar1p免疫球相关的Fe显著减少，这表明Nar1p成熟需要线粒体ISC成分(图5A，第二栏）。在这个时间点上，生长速度与野生型细胞相似，细胞对铁的吸收并没有限制，而是略高于野生型对照(基斯帕语等, 1999;兰格等, 2000). 减少⁵⁵Nar1p中的Fe掺入不是由于葡萄糖的使用就其本身而言因为在野生型细胞中，碳源对⁵⁵Nar1p中的Fe掺入(图5A). 此外，在两种生长条件下，Gal-NFS1和Gal-YAH1细胞中的Nar1p蛋白水平相似，表明在Nfs1p和Yah1p耗尽后，大部分Nar1p处于脱辅基。然而，在缺乏Atm1p的细胞中，Nar1p的水平降低，与⁵⁵铁与免疫球相关。我们推测Nar1p载脂蛋白很容易在Atm1p缺失的细胞中发生蛋白水解，这是Fe/S载脂蛋白常见的行为(基斯帕语等, 1999;陈等, 2002). 为了支持这一观点，Gal-NFS1和Gal-YAH1细胞在补充葡萄糖的培养基中延长生长时间（40小时）后，也观察到Nar1p的大量降解(图5B). 这种影响不是由于葡萄糖培养细胞中的一般蛋白水解，因为两种碳源的胞浆磷酸甘油酸激酶（Pgk1p）水平相似。相反，Nar1p的降解似乎是Nar1p apoform高度不稳定性质的结果。综上所述，将Fe/S簇插入Nar1p需要线粒体ISC组装和出口机械的组件。反过来，这种依赖性支持了我们的发现，即Nar1p是一种Fe/S蛋白。

Nar1p对细胞溶质上的Fe/S簇组装是必需的，但对线粒体、Fe/S蛋白不是必需的

在我们研究Nar1p的细胞功能的过程中，我们考虑了它参与细胞溶质和核Fe/S蛋白的生物生成。为了解决这种可能性，我们首先分析了异丙基苹果酸异构酶（Leu1p）的酶活性，这是一种细胞溶质Fe/S蛋白(基斯帕语等, 1999). 野生型和Gal-NAR1细胞在添加半乳糖或葡萄糖的最小培养基中培养40小时，以分别诱导或抑制Gal-NAR1细胞中Nar1p的合成。当Nar1p被耗尽时，Leu1p酶活性降低了八倍以上，而在野生型细胞中没有发现任何影响(图6A). 由于在Nar1p（插图）耗尽后，Leu1p的蛋白质水平保持不变，这一结果首次表明Nar1p可能是Leu1p成熟所必需的。

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图6

Nar1p是胞质Fe/S蛋白成熟所必需的，而线粒体Fe/S蛋白质则不需要。(A类)野生型和Gal-NAR1细胞在添加半乳糖（Gal）或葡萄糖（Glu）的最小培养基中生长。在总细胞提取物中评估了细胞溶质苹果酸异丙酯异构酶（Leu1p）的酶活性。通过免疫印迹分析（inset）测定Gal-NAR1细胞中Leu1p和Nar1p的水平。(B类)Gal-NAR1细胞在添加半乳糖或葡萄糖的铁盐培养基中生长。用携带HA标记的细胞溶质Rli1p或线粒体Bio2p基因的高拷贝质粒转化细胞。放射性标签⁵⁵铁、细胞提取物的制备和感兴趣的铁/硫蛋白的免疫沉淀如图5对于Leu1p，分析内源性蛋白质。结果显示为⁵⁵Nar1p缺失（葡萄糖生长）细胞和Nar1p-表达（半乳糖生长）细胞中的Fe掺入，校正为小背景（小于半乳糖培养细胞总信号的2%）。通过免疫印迹分析（下面板）测定指示蛋白质的蛋白质水平，并通过密度测定法（上面板）量化。(C类)在含有半乳糖或乳酸（Lac）的最小培养基中生长后，从野生型或Gal-NAR1细胞分离的线粒体中测定顺乌头酸酶和琥珀酸脱氢酶（DH）的酶活性（单位：U/mg线粒体蛋白）。

Leu1p酶活性的丧失可能是由于Fe/S辅因子的合成受损或受损。为了区分这些备选方案从头开始在Gal-NAR1细胞中使用⁵⁵上述铁放射性标记分析。Nar1p耗竭后，与Leu1p相关的放射性标记铁减少了80%，而Leu1p蛋白水平仅下降了15%(图6B). 第二种细胞溶质Fe/S蛋白Rli1p也获得了类似的结果(图6B;兰格等, 2001). 这些结果表明，Nar1p是从头开始细胞溶质Fe/S蛋白的成熟。反过来，研究结果表明，Nar1p缺失细胞中Leu1p酶活性的丧失是由于Fe/S簇组装缺陷，而不是由Fe/S束损伤引起的。

我们接下来测试Nar1p的消耗是否影响线粒体Fe/S蛋白的组装。Gal-NAR1细胞在含有0.1%（w/v）葡萄糖和不可发酵碳源乳酸的最小培养基中培养40小时，以耗尽Nar1p，同时保持线粒体生物发生。在这些生长条件下，与Gal-NAR1细胞在葡萄糖存在下生长后一样，Leu1p活性强烈降低（未显示；参见。图6A和B). Nar1p的缺失几乎不影响分离线粒体中线粒体Fe/S蛋白乌头酶和琥珀酸脱氢酶（复合物II）的酶活性(图6C). 此外，我们调查了从头开始 ⁵⁵Fe/S簇组装成线粒体Fe/S蛋白Bio2p。这个⁵⁵与细胞溶质Fe/S蛋白的研究结果相反，Nar1p耗尽后，Bio2p中的Fe掺入并未减少(图6B). 综上所述，这些结果清楚地表明，Nar1p的缺失会导致细胞溶质上的Fe/S簇组装严重缺陷，但不会导致线粒体Fe/S蛋白的严重缺陷。这一发现与Nar1p与纯化线粒体无关的事实相一致。

Nar1p参与核Fe/S蛋白的成熟

由于对核Fe/S蛋白的生物起源一无所知，我们选择N-糖基化酶Ntg2p作为核Fe-S标记蛋白来研究其成熟度(阿尔塞思等, 1999). 在Gal-NAR1细胞中过度产生了一种HA-标记的Ntg2p，并且通过免疫荧光验证了过度产生的HA-标记Ntg2p的唯一核定位(图7A). HA-tagged Ntg2p的成熟度由⁵⁵如上所述的铁放射性标记和免疫沉淀。Nar1p耗尽后⁵⁵与含有Nar1p的细胞相比，与Ntg2p相关的铁减少了10倍以上，尽管通过免疫染色可以检测到几乎野生型的Ntg2p多肽水平(图7B). 我们从这些发现中得出结论，Nar1p也是核Fe/S蛋白成熟所必需的。

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图7

核Fe/S蛋白Ntg2p的成熟依赖于Nar1p功能。野生型或Gal-NAR1细胞通过编码HA-taged版本Ntg2p的高拷贝质粒（p426-NTG2-HA）进行转化。(A类)通过免疫荧光对过度产生的HA标记的Ntg2p进行定位，如图4A. (B类)细胞在半乳糖（Gal）或含葡萄糖（Glu）铁质最低培养基中生长后，通过以下方法测量Ntg2p的成熟度⁵⁵通过免疫沉淀法与抗HA抗体结合铁，如图5A用缺乏HA标记Ntg2p（−）的细胞进行对照免疫沉淀。插图显示Gal-NAR1细胞提取物中Ntg2p-HA和Nar1p的免疫染色。

缺乏Nar1p的细胞不会在线粒体中积累铁

迄今为止研究的线粒体Fe/S簇组装突变体显示出细胞铁稳态的特征性改变（见Gerber和Lill，2002年). 这些细胞的铁摄取量显著增加，与Aft1p/Aft2p转录因子依赖的铁调节子的组成性表达相关(Foury和Talibi，2001年). 过量的铁在线粒体中积累（参见例如。，基斯帕语等, 1997). Nar1p灭活后是否观察到类似效果？为了解决这个问题，Gal-NAR1和Gal-ATM1细胞中的Nar1p和Atm1p分别在乳酸培养基中生长耗尽（未显示），并分离线粒体。从Nar1p缺失细胞中分离出的线粒体相关铁的总量并不显著高于野生型细胞或含Nar1p-的Gal-NAR1细胞(图8). 相反，Atm1p的耗竭导致线粒体中铁的大量积累(基斯帕语等, 1997). 因此，尽管Atm1p和Nar1p的缺失在细胞溶质Fe/S蛋白的组装中表现出类似的缺陷，但Nar1p-缺失的细胞在线粒体中没有显示出任何铁积累。同样，我们也没有检测到Nar1p缺失后细胞铁吸收效率的任何重大变化（未显示）。我们的结论是，Nar1p的缺失不会导致铁稳态的显著改变，这是在线粒体ISC生物发生机制（包括Atm1p）的蛋白质耗竭时观察到的。

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图8

Nar1p的耗尽不会导致线粒体中的铁蓄积。野生型Gal-NAR1和Gal-ATM1细胞在含有半乳糖（Gal）的最低培养基或乳酸培养基（Lac）中培养40小时。分离线粒体并测定总铁量。

讨论

在本文中，我们提供了Nar1蛋白家族成员的第一个功能特征。这些蛋白质几乎存在于所有真核生物中，与细菌的铁氢化酶具有惊人的序列相似性，但尚不清楚其作为氢化酶的功能。我们发现，酵母Nar1p是一种必需的胞质Fe/S蛋白，含有一个与第二个Fe/S簇相互作用的非同寻常的Fe/S团簇。这些Fe/S簇的生物发生严格依赖于线粒体ISC组装和输出机械的功能。体内使用可调节的NAR1公司突变细胞表明，Nar1p在细胞溶质和细胞核的生物生成中起着关键作用，但在线粒体Fe/S蛋白的生物生成过程中没有起到关键作用。鉴于其活力和Fe/S簇组装途径的保存的本质，参与Fe/S蛋白的生物生成可能是Nar1蛋白家族所有成员的基本功能。Nar1p似乎是真核细胞溶质中Fe/S蛋白生物发生装置的一个新组成部分，该生物发生装置特征不佳。该途径唯一已知的其他成分是胞浆P-loop ATP酶Cfd1p(罗伊等, 2003). 研究这两种蛋白质是通过基因还是直接通过蛋白质-蛋白质结合进行相互作用将是一件有趣的事情。

尽管以前已经注意到在不代谢氢的真核生物中存在铁氢化酶同系物（例如。，维尼（Vignais）等, 2001;霍纳等, 2002;尼科莱特等, 2002)，该蛋白家族的功能作用仍然是个谜。我们证明酵母Nar1p参与细胞溶质和核Fe/S蛋白的生物生成依赖于细胞溶质Fe/S蛋白质Leu1p的酶活性缺陷和细胞溶质Leu1p的显著损伤⁵⁵Fe掺入细胞溶质和核Fe/S模型蛋白。另一方面，线粒体Fe/S蛋白表现出正常活性，并显示出Fe/S簇组装的野生型效率。这些发现排除了Nar1p耗竭在细胞中诱发的条件，这些条件会导致Fe/S簇的一般损伤，例如氧化应激。相反，似乎需要Nar1p从头开始细胞溶质和核Fe/S蛋白的成熟。由于Nar1p在这里被显示为代表Fe/S蛋白本身，这些数据表明Nar1p参与了其自身的成熟。线粒体铁氧还蛋白Yah1p的生物发生类似于“鸡和蛋”的情况，其[2Fe–2S]簇的组装依赖于线粒体ISC机制的存在(兰格等, 2000). Yah1p是这一机制的核心成分，它与铁氧还蛋白还原酶Arh1p一起为支架蛋白Isu1p/Isu2p上的Fe/S簇组装提供电子(穆伦霍夫等, 2003).

目前，我们只能推测Nar1p在Fe/S蛋白成熟中的详细分子功能。与Yah1p一样，Nar1p也可能具有电子传递功能，因为同源的铁氢化酶催化电子穿梭到细菌（如梭状芽孢杆菌、脱硫弧菌）、真核生物寄生虫（毛滴虫、丝氨酸真菌）和绿藻叶绿体（衣藻、小球藻；霍纳等, 2002). 因此，人们很容易推测，在真核细胞溶质中，氢化酶相关Nar1蛋白的电子传递功能被用于一项新的任务，即Fe/S蛋白的生物生成。体外现在有必要在真核细胞溶质中重建Fe/S蛋白成熟过程，并鉴定该途径的进一步成分，以深入了解该过程的分子机制和Nar1p的特殊功能。

Fe/S蛋白组装中线粒体突变体的一个特征和一般表型是线粒体中铁的积累(Gerber和Lill，2002年). 由此产生的Aft1p/Aft2p转录因子依赖性铁调节子的诱导导致细胞铁摄取增加(Foury和Talibi，2001年;卢瑟福等, 2001). ISC出口组分Atm1p、Erv1p和谷胱甘肽合成中的突变体也表现出这种行为(基斯帕语等, 1999;兰格等, 2001;西波斯等, 2002). 由于这些突变体，作为Nar1p缺失细胞，仅在细胞溶质中显示缺陷，而在线粒体Fe/S蛋白中不显示缺陷，因此我们感到惊讶的是，Nar1p-缺失细胞在其细胞铁代谢中没有显示任何即时变化。铁在细胞内的吸收和细胞内的分布均未发生显著变化。显然，酵母线粒体是细胞铁稳态的主控装置。对于铁的调节，细胞器似乎使用的是Fe/S蛋白质代谢产物，而不是另一种由线粒体合成的主要含铁化合物血红素。这种行为与人类细胞明显不同，人类细胞不仅在Fe/S蛋白生物生成缺陷后积累铁，也是由于卟啉代谢受损(贝克里等, 2000;卡佐拉等, 2003). 尽管酵母细胞中铁吸收和分布的调节不太复杂，但我们目前的研究表明，在Nar1p对所有线粒体外Fe/S蛋白成熟具有直接作用的假设下，细胞溶质或核Fe/S蛋白质不太可能参与此调节回路。我们的发现为研究这个有趣的问题提供了可能性。

我们对Nar1p中Fe/S团簇的初步光谱表征表明，存在两个不同的相邻Fe/S簇。其中一个簇产生了异常的菱形EPR信号，而另一个簇只能间接观察到。我们推测，这个不寻常的团簇可能来自一种特殊的立方烷，并且可能含有额外的金属离子。很可能，它是由Nar1p C末端的四个保守半胱氨酸残基协调的。对Nar1p的这一区域进行建模，该区域对应于铁氢化酶的活性中心H簇，这表明在Nar1p中只有含有H簇双核部分的蛋白囊的一侧是保守的，而另一侧则显示出相当大的氨基酸交换(尼科莱特等, 2002). 因此，非保守侧可能执行Nar1p样蛋白的特定功能。进一步的光谱、结构和突变研究有望揭示Fe/S簇的确切性质，并阐明Fe/S蛋白成熟的作用模式。Nar1p上Fe/S团簇的组装体内取决于线粒体ISC机制。因此，Nar1p的行为与酵母胞浆中已知的含有[4Fe–4S]的蛋白质类似，尽管Nar1p似乎携带不寻常的Fe/S簇。细菌铁氢化酶中Fe/S簇合物的生物合成途径尚未阐明(维尼（Vignais）等, 2001)，但根据我们的实验，我们推测细菌ISC机制是Fe/S簇组装的良好候选机制。分析氢化酶中的H簇和Nar1p上不寻常的Fe/S簇的合成是否需要进一步的专门成分，并了解这些成分是否相关，这将是一件有趣的事情。

我们的研究首次报道了核Fe/S蛋白N-糖基化酶Ntg2p的组装。该蛋白的行为类似于细胞溶质Fe/S脱辅蛋白，因为Fe/S簇关联依赖于Nar1p。目前，还不清楚Ntg2p的组装发生在哪里，因为Nar1p的一部分可能位于细胞核中。尽管Nar1p不包含典型的核靶向序列，但一个明显的富含赖氨酸和精氨酸的基序（RKRX₅RKRR；图1)可能会直接瞄准核目标。尽管必须提到的是，该序列在Nar1蛋白家族的其他成员中并不保守，尤其是在使用另一个核定位信号的核仁定位人类Narf中不保守(巴顿和沃曼，1999年). 研究Ntg2p是否可能在细胞核中或已经在细胞质中获得Fe/S簇，无论是共翻译还是翻译后。

我们发现的一个特别有趣的方面是，在进化过程中，Nar1p是如何从其祖先细菌的铁氢化酶发展成为支持细胞溶质Fe/S蛋白组装的因子的。真核细胞液被认为来源于祖先的古细菌细胞，古细菌细胞将α-蛋白杆菌作为内共生体，最终形成含有线粒体的真核细胞。因此，古细菌胞浆可能是支持胞浆Fe/S蛋白生物生成的成分的来源。然而，到目前为止，在古菌中还没有发现仅含铁的氢化酶(维尼（Vignais）等, 2001). 因此，Nar1p前体可能已经逃逸了最初的内共生体，在真核细胞溶质中获得了新的功能。相比之下，细胞溶质Fe/S蛋白成熟所需的P-loop ATP酶Cfd1p很可能来自古生菌，因为同源的Mrp蛋白在这个王国中很保守(雷佩等, 2002).

Nar1蛋白家族已经引起生物无机化学家、进化论者和氢化酶专家的关注。我们对该家族成员Nar1p酵母的功能作用的鉴定，将为其分子作用模式的详细生化分析开辟道路。未来对Fe/S辅因子结构、Nar1p的进化起源和生化功能的深入了解有望进一步加强我们对这些迷人蛋白质的理解。

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