Kit受体酪氨酸激酶靶向突变的小鼠胃肠道间质瘤模型

摘要

Kit编码具有配体依赖性酪氨酸激酶活性的生长因子受体(1–三). Kit配体（KitL）是Kit受体的唯一已知配体(4). 与受体结合的KitL介导受体二聚化、激酶活性激活和自身磷酸化。随后，Kit激活几个信号级联，导致细胞增殖、细胞存活和其他细胞反应。Kit和KitL在白色斑点(周)以及钢材(斯里兰卡)分别在小鼠中的基因座(4–6). 小鼠的突变周和斯里兰卡基因座在胚胎发生期间和出生后动物的几个主要细胞系统中产生缺陷：造血、黑素生成、配子生成和肠起搏细胞。在造血Kit中，受体信号在干细胞层次、红细胞生成、肥大细胞发育和功能、巨核生成和淋巴生成中至关重要(7–10). Cajal间质细胞（ICC）在胃肠道（GI）中起着起搏细胞的作用，并介导肠道神经系统向平滑肌细胞的输入。ICC表达Kit受体酪氨酸激酶，Kit功能的抑制干扰胃肠道的自主运动(11–13).

胃肠道间质瘤（GIST）是人类肠道最常见的间质肿瘤。GIST是一组异质性肿瘤，历史上曾被归类为平滑肌瘤、平滑肌肉瘤或胃肠自主神经肿瘤(14). GIST表示Kit，它们被认为来自Kit⁺或套件^低的基于免疫表型和超微结构相似性，通过体细胞突变获得ICC祖细胞或ICC(15).

最初，我们已经确定配套元件作为一种急性转化猫逆转录病毒的癌基因，HZ4-FeSV(1). 然而配套元件人类肿瘤是最近才出现的。首先，发现人类和小鼠肥大细胞系携带工具包-在人类肥大细胞增多症/肥大细胞白血病中发现了激酶激活环的激活突变，随后也发现了相同的突变(16,17)和生殖细胞肿瘤(18). 最后，对GIST的分析表明，这些肿瘤表达Kit，并且其中大量包含配套元件-激活突变(15,19). 然而，大多数配套元件-GIST的激活突变与第11外显子有关，其他与第9、13和17外显子相关(20). 重要的是，在体外利用突变体的表达鉴定肥大细胞增多症和GIST中发现的几种突变配套元件培养的cDNA证实了模型细胞系统中突变受体的组成活性(15,21). 一种转基因小鼠模型的研究配套元件据报道，在肿瘤发生中，异源启动子表达突变Kit受体(22). 但只观察到急性淋巴细胞白血病和淋巴瘤，没有已知与之相关的恶性肿瘤配套元件发现激活。

人类家族性GIST综合征伴生殖系ICC增生（HP）、色素沉着和/或色素性荨麻疹的病例配套元件已报告有突变(23,24). 这个发现配套元件-激活突变可能是遗传的，这意味着可能培育出携带遗传基因的小鼠配套元件获得功能突变作为一种模型在研究中的作用配套元件在肿瘤发生中。

材料和方法

杂合突变试剂盒的研制^V558版本Δ/+老鼠。对2.4-kb基因进行定点突变Spe公司I–千磅I基因组配套元件包含外显子10–13的片段，删除外显子11中的Val-558。突变体配套元件将基因组片段插入包含Kit外显子8-13的片段中。将位于loxP位点两侧的新霉素耐药基因表达盒插入斯纳内含子9中的Bl位点。对于阴性选择，将Frank Costantini（纽约哥伦比亚大学）提供的白喉毒素a基因盒放置在靶向结构的3′端。129/SvJ胚胎干细胞（GSI-1 P/O，Genome Systems，St.Louis）按照标准协议用线性靶向结构进行电穿孔。分离新霉素耐药ES细胞克隆并进行同源重组分析。首先，通过PCR策略（引物集a/B）筛选ES细胞克隆，其中扩增出一个包含新盒和靶区外第14外显子的5-kb片段。然后通过Southern blot分析验证了正确的靶向ES细胞克隆，并证明存在配套元件^V558版本Δ经序列分析证实。将正确靶向的ES细胞克隆显微注射到C57BL/6J囊胚中，显示85–100%嵌合的雄性小鼠回交给C57BL/6J雌性小鼠进行生殖系传播。

新盒式磁带被切除体内通过将杂合突变雄性与EIIa-核心转基因雌性交配(25). Monica Bessler（圣路易斯华盛顿大学医学院）善意地提供了C57BL/6J背景（N10）的EIIa-核心转基因小鼠。通过使用经酶切的DNA来监测新盒的切除巴姆使用Kit和Neo-specific探针进行HI和Southern杂交分析。此外，通过PCR（lox-PCR：引物集C/D）鉴定了剩余的lox位点和相邻的多个克隆位点。引物为：A，5′-AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAGCG-3′；B、 5′-CTCCGTGAGTGCAGAAGGTTC-3′；C、 5′-ACGATGGGCAAGAGTT-3′；和D，5′-GATACTGTTAACATTTCGATACTTAGC-3′。

肥大细胞培养。骨髓源性肥大细胞（BMMC）配套元件^V558版本Δ/+和对照组小鼠按照出版的方法进行衍生和培养(26). 通过使用抗鼠Kit抗体（StemCell Technologies，Vancouver）和荧光激活细胞分选仪分析监测Kit细胞的表面表达。刺激前，将BMMC洗去生长因子，并在无血清培养基（Stemspan SF Expansion medium，Stemcell Technologies）中培养6小时。

细胞增殖和凋亡。增殖试验基本上按照所述进行(27). 简单地说，10⁵饥饿的BMMC以0.2毫升/孔的剂量接种在96周的平板中，一式三份，然后按指示用KitL（PeProtech，Boston）或IL-3（20 ng/ml）（Sigma）刺激24小时。20小时后，0.5μCi[^三H] 添加胸腺嘧啶核苷4h。在玻璃纤维过滤器上收集细胞并测定β-发射。对于凋亡检测，用IL-3（20 ng ml）刺激细胞12 h。然后在10⁶在六孔板中每2毫升每孔的细胞数，饥饿1小时，用KitL（100 ng/ml）、IL-3（20 ng/ml）刺激，或剥夺50小时。使用Annexin V-FITC检测试剂盒I（PharMinen）通过流式细胞术收集细胞并进行分析。

免疫沉淀法和免疫印迹法。用KitL（100 ng/ml）或不使用KitL在37°C下刺激饥饿的BMMC 5分钟。细胞在含有50 mM Tris·HCl（pH 8.0）、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1%Nonide P-40、2 mM Na的Nonidet P-40裂解缓冲液中进行裂解_三VO（旁白）₄，1mM PMSF，10mM NaF和20μl/ml蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）。用山羊抗Kit抗体（Santa Cruz Biotechnology）将清除的裂解产物沉淀过夜，并通过SDS/PAGE进行分离。对于Western blotting，使用了兔抗Kit（癌基因科学）、兔抗Tyr（P）和鼠抗Tyr20和99（圣克鲁斯生物技术）。为了制备肿瘤裂解物，将1g snap冷冻肿瘤标本在液氮中研磨成粉末，再悬浮在5ml Nonidet P-40裂解缓冲液中，经Dounce-homogenize 20次，并在冰上培养30分钟。按照肥大细胞的描述，对清除的裂解物进行免疫沉淀、SDS/PAGE和Western blotting。

组织学分析和免疫组织化学。对4%的聚甲醛固定组织的石蜡切片（8μm）进行染色或用于免疫组织化学。对于免疫组织化学检测，使用MOM试剂盒（Vector Laboratories）。使用Vector Laboratories的抗Ki-67抗体（NCL-Ki-67-MM1），剂量为0.4μg/ml。对于BrdUrd标记，小鼠腹腔注射BrdUrd（Sigma，50μg/g体重），3h后重复注射，12h后处死小鼠。Roche Diagnostics的抗-BrdUrd抗体（BMC9318）使用6μg/ml。多克隆兔抗Kit抗体（DAKO）使用1:500。根据制造商的说明（加州圣拉蒙BioGenex）进行突触体素染色。

肥大细胞数和外周血参数的测定。皮肤肥大细胞数量的测定如前所述(28). 每0.5 mm的桅杆单元²在几个独立的切片中对表皮和脂膜之间的皮肤进行计数并取平均值。如前所述分析外周血参数(28).

电子显微镜。对于超微结构研究，组织固定在2%戊二醛中，后固定在1%四氧化锇中，并使用标准程序嵌入环氧树脂中。切片用飞利浦EM410电子显微镜检查。

结果

Kit受体基因Kit膜旁结构域的单点突变^V558版本Δ，通过基因靶向获得。深入了解配套元件-激活肿瘤发生中的突变体内我们在小鼠中引入了一种氨基酸缺失突变，配套元件^V558版本Δ，进入老鼠体内配套元件基因打靶技术。在一例人类家族性GIST病例中，发现Kit受体旁膜区的V558缺失突变（人类V559）(23)以及在体外研究表明，这种突变导致Kit受体酪氨酸激酶的组成性激活。此外，Val-559替代突变（小鼠V558）构成GIST中发现的体细胞突变的主要子集（11%）（C.R.a.，未发表的工作）。人和鼠的并列膜域配套元件V558缺失突变将在小鼠和人类中产生相同的功能后果。将V558缺失突变引入配套元件在ES细胞中构建了一个靶向结构，其中包含缬氨酸缺失突变配套元件外显子11和两侧为loxP位点的neomycine抗性（neo）盒，用于随后的去除体内插入内含子9的新盒式磁带（图6，作为PNAS网站上的支持信息发布，网址：www.pnas.org). 通过PCR、Southern blot和测序分析，ES细胞中的同源替换产生了三个正确靶向的ES细胞克隆。将这些ES细胞克隆显微注射到C57BL/6J囊胚中，产生嵌合体，引起生殖系传播。

我们之前已经注意到内含子中包含了一个新磁带配套元件序列干扰配套元件基因(29). 因此我们通过cremediated切除术移除了新的暗盒体内如前所述(29). 存在配套元件^V558版本ΔDNA测序证实突变。两者都是杂合的配套元件^V558版本Δ/+雄性和雌性小鼠都有生育能力，但随着年龄的增长，生育能力受到损害。

杂合试剂盒胃肠道中的肌间丛（Myp）HP和GIST^V558版本Δ/+老鼠。从4周龄开始杂合子突变配套元件^V558版本Δ/+小鼠出现了疾病症状，最终死于胃肠道病理。对突变小鼠和WT小鼠的整个胃肠道的大体检查显示，在12/14个突变小鼠中，末端回肠（巨肠）在盲肠水平处有不同程度的扩张(图1一个). 其余小肠、胃、结肠和肛门外观正常。在9/14突变株中，盲肠扩大和膨胀，并含有透明液体或类似于脓汁的内容物。在所有突变体中，盲肠中发现一个大小从1毫米到2厘米不等的坚固白色结节状肿块。对照组小鼠均未出现胃肠道病变。此外，在7/14个突变株中，在胃食管交界处发现了一个定义明确的黑色素区域。突变体的存活配套元件^V558版本Δ/+小鼠在9个月龄时约为50%(图1B类). 此外，我们杀死的所有动物，无论是否患有致命疾病，都有胃肠道病变。因此，胃肠道疾病的外显率配套元件^V558版本Δ/+小鼠接近100%。

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图1。

(一个)照片显示的是配套元件^V558版本Δ/+和WT小鼠。箭头表示突变小鼠盲肠中的结节性肿瘤肿块。箭头表示胃食管交界处的巨结肠和食道远端色素沉着。(B类)生存情节配套元件^V558版本Δ/+老鼠。

对6只突变小鼠和3只WT小鼠的组织进行了组织学检查，对其食道、小肠、盲肠和大肠的代表性切片进行了显微镜检查（表1，作为PNAS网站上的支持信息发布）。在6个突变体中，有5个被鉴定为食管MyP的斑片状增厚/HP。所有六个突变体的胃MyP HP都相似(图2C类和D类)3例同时累及近端十二指肠。在外观正常的远端十二指肠、空肠和膨胀的回肠（巨结肠）中未检测到MyP-HP(图2一个). 在盲肠中观察到MyP HP始终呈斑块状。扩张的盲肠检查显示正常结肠皱襞萎缩，管腔扩张，有一例脓肿形成并伴有急性浆膜炎(图2B类). 在所有样本中，大肠内的片状MyP HP都很明显(图2E类–G公司). 增生性MyP用Kit抗体呈强扩散染色，表明增生性神经丛的主要细胞成分以ICC为代表（图。​（图2G公司2G公司和​和3C类).三C类). 从6个突变株中的5个中观察到的食道远端黑暗部分的切片（表1）显示了MyP中特异性色素细胞的存在（图7一个和B类，作为支持信息发布在PNAS网站上）。Fontana–Masson染色证实存在黑色素。

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图2。

胃肠道组织学分析配套元件^V558版本Δ/+突变小鼠。从突变体获得的石蜡切片(一个–C、 E类、和G公司)和WT(D类和F类)胃肠道用苏木精/伊红染色。(一个)未感染小肠，MyP正常，用箭头表示。(B类)图示盲肠局灶性脓肿，用星号表示。(C类)图示胃内MyP HP，箭头表示增生性病变。(D类)胃中正常的MyP用箭头表示。(E类和F类)突变体和WT结肠中的MyP增生和正常。(G公司)结肠MyP-HP的抗Kit染色。（放大倍率：×100，一个–G公司; ×200,插图.)

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图3。

胃肠道间质瘤的组织学和免疫组织化学分析配套元件^V558版本Δ/+突变小鼠和人类家族GIST。石蜡切片用苏木精/伊红染色(一个和B类)，抗Kit抗体(C类和D类)，或抗突触素抗体(E类). (F类)石蜡切片苏木精/伊红染色，包括GIST病变和邻近MyP HP。(G公司)MyP-HP苏木精/伊红染色。(H（H）)GIST苏木精/伊红染色。(我)抗Kit染色。黑色箭头表示GIST病变，白色箭头表示MyP HP。（放大倍数：×40，一个和F类; ×20,C类; ×100,B、 E类、和我; ×200,D、 G公司、和H（H）.)

在盲肠中检测到的肿瘤病变具有均匀的梭形细胞形态，涉及肠壁的固有肌层和粘膜下层（表1，图3一个–D类). Kit免疫组化显示梭形细胞具有较强的弥漫反应性(图3C类和D类)和突触素免疫组织化学勾画出肠神经元的胞周和轴突，延伸到肿瘤细胞之间(图3E类). 病变的形态学表现和强烈的Kit免疫反应支持GIST的诊断。用Ki67染色和BrdUrd标记研究肿瘤细胞的增殖特性。与人类肿瘤一样，增殖指数是异质性的，在大多数区域从5%到10%不等，在病灶区域高达20%（未显示）。

为了进行比较，显示了由错义突变Kit-W557R（G.S.，未发表的工作）导致的家族性GIST患者肿瘤和增生病变的组织切片(图3F类–我). 形态学上，人类家族性GIST患者在斑片状MyP-HP背景下GIST的出现和Kit染色模式与在配套元件^V558版本Δ/+老鼠。

对一只突变小鼠的组织进行电子显微镜检查。在超微结构上，发现MyP-HP由大量小而未分化的纺锤形细胞组成，具有短而分支的丝状突起(图4一个)，与ICC HP一致。ICC显示细胞质稀少，有小簇致密线粒体和质膜下空泡。由于ICC的替代，发现并混合了罕见的神经节细胞，轴突突的数量显著减少。超微结构上，GIST由卵圆形至稍纺锤形细胞组成，有适量细胞质(图4B类). 细胞质富含致密的线粒体和突出的高尔基体，缺乏谱系分化特征的细胞器。此外，细胞呈短小的微绒毛样细胞突起，未见明显的基底层。然而，存在罕见的基本细胞连接。

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图4。

MyP HP和GIST的电子显微分析。(一个)箭头表示盲肠MyP增厚，显示大神经节细胞（GLC）和大量未分化的小梭形细胞，具有狭窄的分支细胞突起（ICC）；细胞细胞质稀少，有密集的线粒体和细胞质下液泡。平滑肌细胞。(B类)GIST公司。脱落的饱满纺锤形细胞，细胞核圆至卵圆形，均匀，细胞质中等，由疏松的基质分隔；细胞具有短的“微绒毛样”细胞突起、大量致密线粒体和突出的高尔基体。（放大倍率：×4960。）

食管MyP的色素沉着区包括巨大的卵圆形细胞，细胞浆丰富，充满大量IV期黑色素小体（未显示），它们被不连续的线性基底膜包围（图7D类和E类). 色素细胞与MyP的其他细胞成分混合，如雪旺细胞、轴突突和ICC。

杂合试剂盒中组织肥大细胞和腹膜肥大细胞数量的增加^V558版本Δ/+突变小鼠。KitL和Kit在造血中具有多种作用，包括干细胞室、红细胞生成和肥大细胞(9,10). 有趣的是，杂合突变小鼠的红细胞压积值和红细胞、白细胞、粒细胞和血小板数量没有偏离正常值（未显示）。这一发现与观察结果一致，即家族性GIST患者的稳态造血功能似乎正常。

与未改变的造血参数相比配套元件^V558版本Δ/+小鼠似乎增加了4倍(P（P）= 0.012) (图5一个). 此外，对背部皮肤切片的检查显示，肥大细胞附近有细胞外颗粒，这意味着肥大细胞很容易脱颗粒(图5B类).

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图5。

皮肤中肥大细胞的特征配套元件^V558版本Δ/+小鼠骨髓基质细胞及其增殖和细胞存活特性配套元件^V558版本Δ/+老鼠。(一个)背部皮肤石蜡包埋切片用甲苯胺蓝染色，并计数肥大细胞（每毫米肥大细胞²). (B类)组织切片显示皮肤肥大细胞数量增加。箭头显示颗粒释放到间隙中。(C类)剥夺诱导细胞凋亡。配套元件^V558版本Δ/+和WT BMMC在无血清培养基（SFM）和含有KitL（100 ng/ml）或IL-3（20 ng/ml。实验一式三份。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。(D类)Kit受体的磷酸化配套元件^V558版本Δ/+以及WT BMMC，无论KitL是否在场。在37°C下，用KitL（100 ng/ml）处理饥饿的细胞5分钟。细胞裂解物用抗Kit抗体免疫沉淀，用抗磷酸酪氨酸抗体印迹(上部)，剥离并用抗Kit抗体重新制备(下部). (E类)扩散配套元件^V558版本Δ/+和WT BMMC。用KitL（如图所示）、IL-3或单独培养基刺激细胞20小时[^三H] 然后添加胸腺嘧啶核苷（2.5μCi/ml）4 H。数据表示为三份样品的平均值±标准误差。(F类)肿瘤裂解物中Kit受体的磷酸化。肿瘤裂解物（来自不同动物：GIST编号1、2和3）中的Kit蛋白通过SDS/PAGE进行免疫沉淀和分离。膜上印有抗磷脂酰肌醇抗体(上部)和抗Kit抗体(下部). 显示了使用KitL刺激和未刺激的WT BMMC样品，以进行比较。

突变试剂盒的存活和增殖特性^V558版本Δ/+BMMC。KitL诱导BMMC存活和增殖(27). BMMC从配套元件^V558版本Δ/+小鼠对KitL的细胞存活和细胞增殖有不同的要求。令人惊讶的是，年轻的突变BMMC对KitL生存反应的需求降低，但相比之下，它们对KitL的需求没有改变，以促进细胞周期进展(图5C类和E类). 此外，未刺激突变BMMC中Kit受体磷酸化状态的分析与WT BMMC中的分析没有区别(图5D类). 有趣的是，在延长培养时间后，突变肥大细胞（3个月及以上）（而非WT对照组）的增殖和存活反应变得与因子无关，Kit受体被自动磷酸化（即，未发表的观察结果）。

接下来我们分析了GIST裂解物中Kit蛋白的磷酸化状态。与预期一致配套元件^V558版本Δ/+小鼠Kit受体具有组成活性，我们发现Kit受体在所有肿瘤样本中都是自磷酸化的(图5F类).

讨论

激活基因突变配套元件受体酪氨酸激酶与人和狗的肿瘤和HPs相关(15,17,30). 虽然GIST和犬肥大细胞瘤最常在Kit受体的膜旁结构域发生突变，但人类肥大细胞病的突变主要涉及Kit激酶的激活环(17,31). GIST与Kit活化突变高度相关，表明活化的Kit受体在肿瘤发展中起关键作用(20). 与这一概念一致，已有家族性GIST病例报告配套元件-激活生殖系中的突变(23). 我们引入了一种突变，配套元件^V558版本Δ/+，发现一例人类家族性GIST综合征进入小鼠生殖系，产生GIST和Kit突变相关造血疾病的小鼠模型。明显地，配套元件^V558版本Δ/+小鼠复制与该突变相关的人类条件，包括MyP-HP、GIST和肥大细胞增多症。在晚期人体GIST中，未发现肝或腹腔转移。GI表型的外显率配套元件^V558版本Δ/+老鼠很了不起。这些观察结果强烈表明，组成性Kit信号传导对于这些小鼠中HP和肿瘤的诱导至关重要，并且足够。

GIST被认为源自ICC。ICC定位于MyP（ICC-MY）和整个肠道的肌层（ICC-IM）内，从食道远端到直肠(32). 然而，突变动物中的HP呈斑块状，仅在MyP中明显，GIST的肿瘤病变主要在盲肠的MyP中发现。ICC-MY在促进慢波活动、产生蠕动和神经传递方面具有双重作用。相反，ICC-IM和深肌丛ICC主要在神经传递中发挥作用(32). 因此，该位点和不同的功能特性可能有助于不同ICC亚群的致癌潜力。人类和小鼠盲肠的解剖结构有很大不同，因为小鼠盲肠更长。因此，与人类散发性GIST的胃或小肠相比，小鼠盲肠作为主要病理部位的参与可能是由于小鼠和人类盲肠的不同解剖特征所致。增生性和肿瘤性病变的斑片状外观可能表明突变Kit受体信号限制启动肿瘤发生，或者启动HP和肿瘤发生需要额外的事件。最近人类散发性GIST的细胞遗传学特征表明一系列变化可能是GIST进展的特征(33). 小鼠肿瘤的细胞遗传学分析可能有助于确定GIST发展的关键步骤。ICC HP和GIST病变的组织学和超微结构特征反映了人类疾病的组织学特征。与人类GISTs相比，Kit在肿瘤和增生性病变中的表达是弥散的和强烈的。在超微结构上，肿瘤细胞缺乏向任何特定谱系如平滑肌或神经元的明显分化。具有分支细胞突起和致密线粒体的细胞的未分化外观使人想起电子显微镜下的ICC。

在胚胎发育过程中，间充质祖细胞产生纵向平滑肌细胞和ICC-MY(34,35). Kit受体在祖细胞中表达，随后在ICC中表达(35,36,37). 有人提出，是否遵循ICC或平滑肌细胞命运的决定取决于Kit受体信号传导。如果这是真的，那么有人可能会预测，由于组成性Kit受体信号，突变小鼠的平滑肌细胞分化减弱。然而，突变小鼠的纵向平滑肌层与正常对照组没有差异。一方面，这可能意味着这个假设是无效的；另一方面，可能是来自配套元件^V558版本Δ受体太弱，无法影响细胞命运的决定。

突变小鼠的回肠和盲肠扩张部分可能是由于胃肠道部分堵塞所致；或者，突变的Kit受体可能会影响功能性ICC网络的形成，因此这可能会影响慢波活动和/或神经传递功能，并产生mega-ileum。因此，更详细地描述ICC网络、ICC的功能特性以及突变小鼠的慢波活动和神经传递特性将是很有意义的。

迁移开始后的神经嵴细胞越来越限制细胞增殖和分化的潜能(38). 然而，有证据表明神经嵴衍生细胞群分化细胞命运的可塑性。而在外周神经细胞培养中，双能祖细胞同时产生黑素细胞和雪旺细胞在体外-分化的雪旺细胞可能转分化为黑素细胞(39). 我们推测突变小鼠食道远端增厚MyP中的黑色素生成细胞来源于雪旺细胞。环境线索和雪旺细胞中激活的Kit受体可能会促进这种转分化。

Kit受体与肥大细胞的发育、增殖和存活密切相关(4,40). 此外，Kit促进介质释放并增强IgE依赖性肥大细胞激活。因此，对正常小鼠重复皮下注射KitL可增加不同解剖部位的肥大细胞数量，并诱导肥大细胞活化和相关炎症反应(41,42). 已知包括色素性荨麻疹在内的人类肥大细胞增多症与配套元件受体激活突变(17,31). 包括皮肤、骨髓和脾脏在内的不同部位肥大细胞数量增加是该病的典型特征。虽然人类肥大细胞增多症中的激活突变主要局限于激酶的激活环，但也注意到了膜旁结构域的突变(17,43). 与此一致的是，据报道，家族性GIST患者的膜旁结构域突变与肥大细胞增多症和/或色素性荨麻疹有关。因此，在突变小鼠中发现皮肤肥大细胞数量增加，这一发现意义重大，再次反映了人类疾病。有趣的是，背部皮肤的组织学分析显示，组织肥大细胞似乎已向真皮释放颗粒，可能反映了肥大细胞的激活。

体外描述配套元件^V558版本ΔBaF/3细胞的突变表明配套元件^V558版本Δ突变促进细胞增殖，从而消除BaF/3细胞对生长因子的依赖性(23). 我们的结果来自在体外突变体分析配套元件^V558版本Δ/+BMMC似乎更为复杂。年轻的BMMC培养物对生长因子缺失诱导的凋亡不敏感。然而，这些培养物并没有促进细胞周期的进展。只有在长时间培养（3个月）后，突变BMMC才能完全独立于KitL诱导的存活和细胞周期进展。选择性剪接产生两种不同的Kit蛋白，在受体的胞外区差异4 aa(44). 越来越多的证据表明，短Kit蛋白产品比长Kit蛋白更具活性。因此，Kit长变体可能主要在年轻的突变体BMMC中表达，而较老的培养物表达Kit短变体，这可能解释了这些培养物从部分生长因子独立性到完全生长因子独立性的进展。

Kit在造血干细胞和所有造血细胞系的祖细胞室中起着关键作用。因此，人们可能会期望配套元件^V558版本Δ突变会影响造血的几个方面，也可能影响淋巴生成(10,45). 然而，血统阴性造血干细胞亚群和T细胞祖细胞亚群是正常的，稳态造血参数不受突变的影响。与这一观察结果一致，在系统性肥大细胞增多症患者的淋巴和髓细胞中发现携带突变型配套元件基因，表明突变包含在具有淋巴、髓和肥大细胞潜能的自我更新干细胞亚群中，并表明Kit突变可能不会直接影响淋巴和髓细胞的成熟(46).

靶向药物治疗恶性肿瘤最近取得了首次临床突破性成功。酪氨酸激酶抑制剂STI571（Gleevec，诺华公司）是ABL、PDGFR和Kit激酶的抑制剂，已成功用于治疗慢性粒细胞白血病患者(47). 此外，STI571正被用于治疗GIST患者，这是一种以前没有治疗选择的疾病(48). 这些结果强调了bcr-abl和组成活性Kit受体在这两种疾病的病因中的关键作用。这个配套元件^V558版本Δ/+小鼠模型应该为研究药物治疗对肿瘤发展的影响提供一个有用的工具。

补充材料

致谢

笔记

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

缩写：KitL，Kit-ligand；ICC，Cajal间质细胞；胃肠道；胃肠道间质瘤；ES，胚胎干；骨髓源性肥大细胞；HP、增生；MyP，肌间神经丛。

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