RNA聚合酶II（Pol II）需要两种通用转录因子（GTF）在启动子处形成稳定的起始复合物（参考文献综述6,24、和60)以及介体和辅激活子，以传递来自转录激活子和阻遏物的信号（参考文献综述36). 含有许多辅助因子的Pol II大的、表面上预先组装的形式可能是体内酶的实际起始形式。然而，最近的研究表明，在缺乏Pol II的情况下，介体复合物也可能发挥作用(7,3a年,40). Pol II的这些全酶形式的最佳特征是来自酿酒酵母（在参考文献中审查34和35). 除核心Pol II外，该复合物还包含介体，约20个蛋白质的集合，包括Srb蛋白质和GTFs转录因子IIB（TFIIB）、TFIIF、TFIIE和TFIIH。多细胞生物中也描述了类似于酵母Srb-介体的复合物（参考文献综述13).
我们的实验室已从含有Paf1、Cdc73、Hpr1和Ccr4的酵母中分离出Pol II复合物并对其进行了表征，该复合物在生化上与Srb-介体复合物不同(4,47,57). Paf1复合物包含TFIIF和TFIIB以及Srb-介体复合物中也存在的辅活化子Gal11和Sin4。然而，在Paf1复合物中未发现Srb和Med蛋白，在Srb-介体复合物的蛋白中未发现Paf1、Cdc73、Hpr1和Ccr4。虽然编码Paf1复合物成分的基因不是必需的，但这些基因的突变表现出多种表型，表明基因表达缺陷(4,47; J.L.Betz、M.Chang、T.M.Washburn、S.E.Porter和J.A.Jaehning提交出版）。与这些表型一致，Paf1复合物基因的突变导致酵母转录物的一个小但重要的子集的丰度发生变化(4,47; M.Chang、J.Fostel和J.A.Jaehning，未发表的数据）。相反，许多编码Srb和Med蛋白的基因是必需的（参考文献中综述34)，并且至少一种必需的Srb蛋白（Srb4）的缺失导致大多数（如果不是全部的话）酵母基因的表达减少(18).
在缺乏Paf1的菌株中差异表达的转录物包括细胞壁生物合成基因(4)以及许多细胞周期调控基因（S.E.Porter、R.M.Washburn、M.Chang和J.A.Jaehning，提交出版）。Paf1、Cdc73或Ccr4的缺失会导致细胞壁完整性缺陷，Paf1，Cdc73和Hpr1的缺失与直接重复序列之间重组率的升高有关(4). 事实上，在蛋白激酶C-有丝分裂原激活的蛋白激酶信号通路的基因突变中也观察到这两种其他不相关的表型，这一事实使我们确定Paf1复合物在Pkc1向下游靶基因的信号传递中起着重要作用(4). 虽然Paf1和Cdc73尚未在其他配合物中鉴定出来，但Hpr1和Ccr4都存在于其他非Pol II配合物中。Hpr1是影响转录和重组的Hpr1/THO复合物的一部分(5)，Ccr4是Ccr4/Caf1/NOT复合物的一部分，在转录合成和转换中起作用(27,28,52).
最近，Koch及其同事确定Paf1和Cdc73是与Ctr9相关的因子，Ctr9是G1细胞周期蛋白CLN2型(22). Paf1或Ctr9的缺失导致类似的严重多效性表型，这两个基因的缺失不会导致表型增强。这些遗传和生物化学观察结果与Ctr9和Paf1在同一途径中发挥作用的观点一致。为了进一步表征Paf1复合物，并确定Ctr9是否也是该复合物中PolⅡ相关蛋白之一，我们使用了串联亲和纯化（TAP）(43)分离Paf1复合物的系统。我们已确认Pol II复合体中存在Ctr9，并已确定Paf1复合体的新成分，包括Rtf1和Leo1。Srb-介体复合物中没有这些新识别的因子，这进一步确立了这两种Pol II形式之间的生化差异。我们观察到Rtf1或Leo1的缺失抑制了许多由Paf1或Ctr9缺失引起的多效性表型，这使我们找到了Paf1复合物在酵母基因转录中作用的新模型。
材料和方法
酵母菌株、生长条件和遗传技术。
这个酿酒酵母本研究中使用的菌株来源于菌株YJJ662(材料一 吕2Δ1声嘶嘶声3Δ200乌拉3-52) (47)除YJJ577所示的特定缺失或修改外，均为等基因(paf1Δ::HIS3型)、YJJ1303(rtf1Δ::坎第页)、YJJ1326(rtf1Δ：：kanr paf1Δ：：HIS3)、YJJ1336(狮子座1Δ::坎第页)、YJJ1339(trp1型Δ::坎第页)，邮编：1361(leo1型Δ::坎r paf1Δ：：HIS3)、YJJ1364(ctr9键Δ::坎r paf1Δ：：HIS3）。下面描述了TAP标记和血凝素（HA）标记菌株结构的详细信息。YJJ1339被用于产生HA标记的Leo1，产生菌株YJJ1330[Leo1::低地球轨道1HA6型(KlTRP1号机组)]. TAP标记菌株来源于YJJ662，包括YJJ1307[CDC73型::CDC73型CBP-TEV-ProtA公司(克鲁拉3)]、YJJ1308[SRB5号机组::SRB5号机组CBP-TEV-ProtA公司(克鲁拉3)]、YJJ1329[CTR9号机组::CTR9号机组CBP-TEV-ProtA公司(克鲁拉3)]、YJJ1334[HPR1型::HPR1型CBP-TEV-ProtA公司(克鲁拉3)]. 同时含有Leo1-HA和TAP标签的菌株为YJJ1309[CDC73型::CDC73型CBP-TEV-ProtA公司(克鲁拉3)低地球轨道1::低地球轨道1HA6型(KlTRP1号机组)]，邮编：1331[SRB5型::SRB5号机组CBP-TEV-ProtA公司(克鲁拉3)低地球轨道1::低地球轨道1HA6型(KlTRP1型)]、YJJ1332[CTR9号机组::CTR9号机组CBP-TEV-ProtA公司(克鲁拉3)低地球轨道1::低地球轨道1HA6型(KlTRP1号机组)]. 使用标准方法在含有2%葡萄糖的YPD中培养菌株(15).
TAP标记菌株的构建。
酵母染色体基因CDC73型,SRB5号机组,HPR1型、和CTR9号机组是用C末端TAP标记的表位(43). 标签盒由两个免疫球蛋白G（IgG）结合域组成金黄色葡萄球菌蛋白A和由烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶位点分离的钙调素结合肽。这个乳克鲁维酵母URA3位于标签3′端的基因作为选择标记。PCR片段使用与感兴趣基因的最后51 bp对应的5′寡核苷酸（不包括终止密码子）加上与TAP标签匹配的17 bp，以及与终止密码子下游51 bp相对应的3′寡核苷酸加上标签盒的17个碱基生成。寡核苷酸序列可根据要求提供。PCR片段转化为菌株YJJ662，产生菌株YJJ1307（Cdc73-TAP）、YJJ1302（Srb5-TAP）、YJ1329（Ctr9-TAP）和YJJ1334（Hpr1-TAP）。通过Western blotting和PCR证实TAP标记的结构。
Leo1-HA菌株的构建。
Leo1是使用pYM3质粒标记的C末端表位(19)包含六个HA肽和一个乳杆菌TRP1标记。为了选择缺乏Trp的合成完整培养基，TRP1号机组在YJJ662中删除，使用KANMX4暗盒(54)，得到YJJ1339。如上所述生成了TAP标记的构造。将Leo1-HA PCR片段转化为YJJ1339。产生的含有Leo1-HA的菌株为YJJ1330（Leo1-HA）、YJJ1309（Cdc73-TAP，Leo1-RA）、YJ1331（Srb5-TAP，Leo1-HA）和YJJ1332（Ctr9-TAP，Lio1-HA）。通过Western blotting和PCR证实了HA标记的结构。
TAP标记复合物的提取物制备和纯化。
TAP标记菌株在YPD培养基中生长，密度为2×107细胞/ml，和转录活性全细胞提取物如前所述制备(56). 简言之，蛋白质颗粒在NH后再次悬浮4SO公司4缓冲液A中的沉淀（20 mM HEPES-KOH[PH7.9]，10%甘油，10 mM EGTA，10 mM-MgSO41 mM二硫苏糖醇[DTT]、1 mM苯甲基磺酰氟[PMSF]、2 mM苯甲脒盐酸盐、亮氨酸蛋白酶抑制剂[0.5μg/ml]、bestatin[0.35μg/ml'、胃蛋白酶抑制素[0.4μg/ml]]）的最终蛋白质浓度为20至30 mg/ml。再悬浮的蛋白质在含有100 mM NH的缓冲液a中进行广泛透析4SO公司4将约1 g总蛋白与500μl兔IgG琼脂糖（Sigma）在4°C下孵育2 h。用50 ml缓冲液A将珠子洗涤三次，然后在TEV蛋白酶裂解缓冲液中平衡（20 mM HEPES-KOH[pH8.0]、10%甘油、0.5 mM EDTA、1 mM DTT、1 mM-PMSF、2 mM盐酸苯甲脒、亮氨酸蛋白酶[0.5μg/ml]、bestatin[0.35μg/ml]、pepstatin[0.4μg/ml]]）。通过在1 ml TEV蛋白酶裂解缓冲液中添加200 U TEV蛋白酶，并在室温下培养混合物2 h，从珠中洗脱蛋白质。洗脱的蛋白质用Centricon YM-30过滤器（Millipore）浓缩，并以0.2 ml/min的速度施加到Superose 6 HR 10/30（Pharmacia）中凝胶过滤柱在缓冲液B[30 mM HEPES-KOH（pH 7.9）、8%甘油、2 mM EDTA、2 mM-EGTA、0.1 M（NH4)2SO公司4，0.05%NP-40，5 mMβ-甘油磷酸，1 mM DTT，1 mM-PMSF，2 mM苯甲脒盐酸盐，亮普肽（0.5μg/ml），贝斯他丁（0.35μg/ml。收集分数（200μl）。部分为三氯乙酸（TCA）沉淀(38)并通过Western blotting进行分析。如其他地方所述，通过非选择性转录试验测量转录活性(58). 为了估计蛋白质复合物的大小，使用以下标记物校准Superose 6色谱柱：聚集的MCM蛋白（>2000 kDa；科罗拉多大学健康科学中心X.Chen馈赠）、甲状腺球蛋白（669 kDa）、脱铁蛋白（443 kDa。
Leo1-HA复合物的分离。
C末端的Leo1 HA标记菌株在100 ml YPD中生长，密度为1.4×107细胞/ml。将细胞造粒并在无菌水中清洗，在液氮中冻融，然后再悬浮在1.0 ml全细胞提取物裂解缓冲液中[0.2 M Tris-HCl（pH 7.9），0.39 M（NH4)2SO公司4，10 mM硫酸镁4、20%（体积/体积）甘油、1 mM EDTA、1 mM DTT和1 mM PMSF，以及上述蛋白酶抑制剂]。加入1ml玻璃珠溶解细胞，并在冷却时旋转四次，持续1min。用Baxter Biofuge 13在4°C下以13000 rpm澄清裂解液20分钟。蛋白质浓度通过Bradford试验（GibcoBRL）测定。大约1.5 mg总蛋白用于TAP标签纯化或免疫沉淀。将TAP标记的提取物与25μl兔IgG琼脂糖在4°C下孵育2 h。将在TEV蛋白酶裂解缓冲液中平衡的珠子用1 ml缓冲液B洗涤三次。在50μl TEV蛋白酶分解缓冲液中加入25 U TEV蛋白酶，从珠子中洗脱蛋白质。洗脱液经TCA沉淀并用Western blotting分析。
菌株YJJ662和YJJ1330用于免疫沉淀研究。为了减少非特异性蛋白质与蛋白A偶联珠的结合，将提取物与25μl Sepharose 4B（Sigma）在4°C下预孵育1 h。去除小球，添加1μl 12CA5抗体（Roche），并在4°C下培养提取物1 h。为了分离Leo1-HA复合物，将固定在Sepharose 4B（Sigma）上的蛋白A添加到提取物中。在4°C下结合1 h后，将珠粒制成丸，并用缓冲液B洗涤四次。珠粒悬浮在20μl NuPAGE LDS样品缓冲液（Invitrogen）中，并加热到70°C 10 min，等分样品在4-12%Bis-Tris NuPAGE凝胶（Invit罗gen）上溶解。
蛋白质印迹。
蛋白质在4到12%的双Tris NuPAGE凝胶上溶解，然后转移到聚偏二氟乙烯（Millipore）膜上。用以下初级抗体检测蛋白质：抗Rpb1（8WG16；D.Bentley）；抗Cdc73、抗Paf1和抗TFIIB（X.Shi）；抗Srb5（R.Young）；抗HA（罗氏）；抗Spt5（G.Hartzog）；抗Rtf1（K.Arndt）；以及抗Rpt5和抗Rpt6（Sug1）（R.Deshaies）。辣根过氧化物酶偶联抗体是二级抗体，蛋白质使用NEN的化学发光试剂盒检测。
质谱分析。
将Superose 6凝胶过滤柱中的馏分混合，TCA沉淀，并在4-12%的Bis-Tris NuPAGE凝胶上溶解。用NOVEX胶体蓝染色观察蛋白质。如前所述，切除蛋白质带并进行处理(25). 简单地说，通过在100 mM NH中与2.8 mM DTT孵育，样品被还原并烷基化4一氧化碳三在60°C下保持15分钟，然后添加10μl 100 mM碘乙酰胺。在黑暗环境温度下培养15分钟后，用100μl 50%乙腈在50 mM NH中清洗凝胶片4一氧化碳三摇动20分钟。为了使凝胶片脱水，添加100μl 100%乙腈并孵育10分钟。去除溶剂，并在真空离心机中完全干燥凝胶片。在10μl 25 mM NH中添加0.2μg改性胰蛋白酶（Promega），使凝胶块膨胀4一氧化碳三。在用25 mM NH进行酶解（37°C，过夜）期间，凝胶片保持湿润4一氧化碳三收集含有消化肽的上清液，用20μl 1%三氟乙酸从凝胶中提取剩余肽两次。将所有上清液汇集在一起，并在真空离心机中干燥。在3至5μl的1%三氟乙酸中重新配制样品，并使用C18 Ziptips（Millipore）脱盐。样品在PE-Biosystems Voyager DE-PRO矩阵辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）光谱仪上进行处理。使用蛋白质浏览和ProFound程序，使用大量胰蛋白酶肽来搜索候选蛋白质。最多允许两个未消化的胰蛋白酶位点和±1.0 Da的质量耐受性。
RNA分离和分析。
细胞生长到1.3×10的密度7每毫升细胞数，按所述分离RNA(4). 根据标准方法，通过甲醛凝胶电泳分离每个样品的15微克总RNA(33). RNA被转移到ZetaProbe GT膜（Bio-Rad）。这个CLN1型探针，一个凝胶纯化的500-bp片段，来自含有1.2-kb的质粒CLN1型编码区（R.Sclafani）用随机素数方法（RadPrime试剂盒；GibcoBRL）标记。18S rRNA寡核苷酸探针（5′-GCTTAACTTAGACATGCAT-3′）为5′末端标记。杂交和清洗在64°C下进行CLN1型18S rRNA探针为探针或41°C。将印迹暴露在荧光成像屏幕上，并使用Quanity One成像软件对条带进行量化。将信号标准化为18S rRNA。
结果
Paf1复合物的亲和纯化。
以前对Paf1复合物的研究使用亲和纯化技术来建立与Pol II的连接，并鉴定复合物的一些成分。Paf1和Cdc73最初被鉴定为RNA Pol II相关蛋白，使用针对Pol II的C末端结构域（CTD）的单克隆抗体从酵母转录提取物中分离酶(57). RNA Pol II相关蛋白还包括GTFs TFIIF和TFIIB。随后，使用GST标记的Paf1、Cdc73和TFIIF形式证明该复合物与Pol II的Srb-介体形式不同，并且Hpr1和Ccr4也与该复合物相关(47). 虽然质粒携带的GST标记的构建物在功能上补充了它们替换的基因(47)，相对于基因的自然染色体拷贝，它们过度表达。此外，GST标签和相关蛋白的二聚化(32,41)导致难以确定综合体的大小。因此，为了进一步表征Paf1复合物的组成和功能，并将其与Srb-介体复合物进行比较，我们对CDC73型和SRB5号机组带有TAP标签(43)，如材料和方法中所述。TAP标签包括两个IgG结合域和一个由TEV蛋白酶位点分离的钙调素结合肽。这个C末端标记不应改变标记基因从其天然启动子的正常表达。与此假设一致，我们发现TAP标记的菌株没有显示这些基因缺失突变体的任何多效性表型（包括生长缓慢和温度敏感性）（数据未显示）。
从标记菌株中制备酵母全细胞转录提取物，通过与IgG琼脂糖结合分离TAP标记结构，并通过TEV蛋白酶消化洗脱结合蛋白。我们发现，Cdc73标记的Paf1复合物和Srb5标记的Srb-介体复合物都可以通过该程序分离出来（见下文），但这两种复合物都不稳定，无法用钙调蛋白珠进行后续纯化。显然，与Pol II的相互作用在第二严格亲和步骤中并不稳定，尽管它们保持在高盐（100 mM NH）下4SO公司4)与IgG琼脂糖结合的条件。图显示了与TAP标记的Cdc73和Srb5相关的蛋白质的IgG琼脂糖分离结果。用Pol II（αRpb1）、Paf1（αPaf1）和Srb5（αSrb5）最大亚单位的抗体对两种制剂的输入、流通和洗脱部分进行检测。Pol II明显与两种标记蛋白相关，Paf1仅存在于TAP标记的Cdc73洗脱液中，Srb5（以其标记形式）在TAP标记Srb5洗脱液（图。). 这些结果表明，TAP标签协议能够特异有效地从标记菌株中分离出不同的Pol II复合物。
Paf1杂岩不同于Srb-Med杂岩。用兔IgG琼脂糖培养TAP标记的Cdc73株（YJJ1307）和Srb5株（YJ J1308）的全细胞提取物。洗去未结合的蛋白质，并通过添加TEV蛋白酶洗脱与TAP-Cdc73相关的蛋白质。将组分（IP，输入；FT，流通；E，洗脱液）加载到4-12%NuPAGE凝胶上，并用所示抗体进行Western blotting分析。星号表示来自IgG琼脂糖柱的交叉反应IgG，箭头表示TEV蛋白酶裂解形式的TAP-Srb5。我们观察到与α-Paf1抗体的两条交叉反应带（参见图。和参考47); 然而，TAP标记的Srb5洗脱液中的开环指示的微弱带并不对应于Paf1的任何一种形式，并且其存在不可重复（见图。).
为了进一步纯化Paf1复合物，它在Superose 6凝胶过滤柱上通过色谱分离（图。). 使用图中所示的抗体通过免疫印迹法监测Paf1复合物成分的洗脱曲线。观察到含有Pol II、Paf1、Cdc73和TFIIB但不含有Srb5的高分子量络合物在约1.7MDa下从柱洗脱。Cdc73存在于高分子-质谱复合物中，也位于与少量Pol II重叠的中间位置。因为已知Cdc73直接绑定Pol II(47)，这可能代表较大Paf1复合体的亚复合体。我们还观察到低分子量组分（～600 kDa）中有大量的游离核Pol II，这是分馏中的一个位置，也含有蛋白水解形式的Paf1（图。，另请参见下文）。当TAP标记的Srb5复合物在相同条件下在Superose 6上分馏时，我们发现所有的Pol II都处于游离核的低分子质量位置，这表明Paf1复合物可能比Srb介体复合物更稳定地纯化。
Paf1复合物约为1.7 MDa。与Cdc73-TAP相关的蛋白质经IgG琼脂糖层析和TEV蛋白酶洗脱后，在Superse 6凝胶过滤柱上进行凝胶过滤层析。在4-12%NuPAGE凝胶上分离组分，并用所示抗体进行Western印迹分析。通过使用材料和方法中所述的指定标准校准凝胶过滤柱来确定尺寸。
除了Pol II的抗体鉴定外，我们还对Superose 6组分的RNA聚合酶活性进行了非特异性转录检测。在对应于高分子量Paf1复合物的分数39至47以及对应于核心Pol II的分数69至73中检测到转录活性（数据未显示）。对GST标记的构建物进行类似的非选择性转录分析（参见参考文献47)发现约2%的Pol II总量与Paf1复合物有关（数据未显示）。
用质谱法鉴定Paf1复合组分。
为了鉴定和1.7-MDa TAP标记的Cdc73复合物相关的蛋白质，我们对从十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶中切除的单个蛋白质带进行了质谱分析（图。). 如材料和方法中所述，用MALDI-TOF质谱法洗脱并分析胰蛋白酶消化蛋白中的肽。胰蛋白酶肽块用于在多个基于Web的数据集中搜索候选蛋白质（ProFound、protein Prospector和MASCOT）。如果排名靠前的候选人的概率分数接近1.0，而排名第二的候选人的可能性明显较低，则认定为阳性。以这种方式鉴定的蛋白质标记在图中。新鉴定的Paf1复合物蛋白包括Ctr9、Rtf1和Leo1。图中鉴定的核糖体蛋白。是高分子量组分中的非特异性污染物，其他分离酵母复合物的方法也观察到了这一点(28,29,45). 在含有Rpb2和Ctr9的同一凝胶带中也鉴定出了一些与Spt5相对应的肽，但较低的概率分数排除了自信匹配（如图中括号所示。). 我们还分析了含有游离Pol II的低分子量组分中的蛋白质（图。580至670 kDa）。我们能够明确地识别大多数Pol II亚单位，以及Leo1和Paf1的完整形式和蛋白水解形式。
Ctr9、Rtf1、Leo1和Spt5与Paf1复合物相关。将Superose 6凝胶过滤柱中的37至41和69至73馏分混合，TCA沉淀，并在4至12%NuPAGE凝胶上分离。蛋白质条带通过胶体蓝染色显示，并处理用于MALDI-TOF分析。对准确鉴定的蛋白质进行标记。
验证新发现的Paf1复合因子。
为了证实质谱鉴定，我们通过蛋白质印迹显示Rtf1和Spt5与Pol II和Paf1存在于相同的高分子量复合物中（图。). 此外，我们在Pol II复合体和自由核Pol II之间的中间部分中观察到Rtf1和Spt5，这表明它们可能存在于一个单独的亚复合体中。
科赫实验室描述了Ctr9、Paf1和Cdc73之间的联系，但没有建立与Pol II的联系(22). 为了确认Ctr9是Paf1复合物的一部分，我们构建了一株带有TAP标记形式的Ctr9的菌株，并确认标记的菌株具有野生型表型。我们为TAP标记的Cdc73分离了如上所述的TAP标记Ctr9-相关蛋白。使用Pol II和Paf1特异性抗体对Superose 6凝胶过滤柱的部分进行免疫印迹（图。). Paf1和Pol II都存在于这些组分中，同样存在于高分子质量络合物和自由核Pol II的位置。根据这些观察结果和质谱鉴定，我们得出结论，Ctr9是Paf1复合物的一部分。
Ctr9和Hpr1均与RNA Pol II和Paf1相关。（A） 从TAP标记的Ctr9菌株（YJJ1329）中纯化Ctr9相关蛋白。样品在Superose 6凝胶过滤柱上分离，并用所示抗体进行免疫印迹。（B） 从TAP标记的Hpr1菌株（YJJ1334）中纯化Hpr1相关蛋白。样品在凝胶过滤柱上分离，并用指示的抗体进行免疫印迹。
我们之前使用GST标记的Hpr1形式来确定该蛋白与Pol II和Paf1相关(4). 因为Hpr1也发现于另一种非PolⅡ复合物中，即Hpr1/Tho复合物(5)，我们通过分析与TAP-tagged Hpr1相关的蛋白质来确认Pol II关联。Pol II、Paf1和Hpr1在Superose 6色谱柱的高分子质量分数中的结合（图。)重申Hpr1与Paf1复合物有关。
除了Leo1是一种由非必需基因编码的非常亲水的蛋白质之外，关于Leo1的信息很少(30). 因此，我们在野生型和不同TAP标记背景中构建了含有染色体HA标记Leo1的菌株（材料和方法）。使用抗HA抗体沉淀HA标记的Leo1，我们在结合组分中发现Paf1和Rtf1，但没有发现Srb5（图。). 然而，尽管未标记菌株的沉淀物中不存在Paf1，但检测到少量Rtf1。我们在这些研究中进行的许多不同亲和力测定中观察到Rtf1的低水平非特异性关联（另见下文）；然而，Rtf1的特定关联在图中很明显。在这个背景下。为了证实Leo1与Paf1复合物特异相关，我们使用了双标记菌株（TAP标记加上Leo1-HA），首先用TAP标记分离复合物，然后探测是否存在HA标记的Leo1（图。). 我们发现Leo1与Paf1和Rtf1一样，与TAP标记的Cdc73和Ctr9相关，但与TAP标签的Srb5无关。这些结果证实Leo1是Paf1复合物的一部分，而不是Srb-介体的一部分。
Leo1-HA与Paf1复合物相互作用，但与Srb-Med复合物不相互作用。（A） Leo1-HA与Paf1和Rtf1的共免疫沉淀。按照材料和方法中所述，用抗HA（12CA5）抗体对从野生型（YJJ662）或Leo1-HA株（YJJ1330）制备的全细胞提取物进行免疫沉淀。使用所示抗体通过Western blotting分析免疫沉淀物。IP，输入；UB，未结合部分；B、 结合分数。（B） Leo1-HA的TAP标签纯化。如材料和方法中所述，用IgG珠培养由含有TAP标签和Leo1-HA标签的菌株（YJJ1309、YJJ1331和YJJ1323）制备的全细胞提取物。洗涤后，加入25 U TEV蛋白酶从珠中洗脱蛋白质。用TCA沉淀洗脱液，并用所示抗体进行免疫印迹分析。IP，输入；FT，流通；E、 洗脱液。
蛋白酶体成分不是Paf1复合物的一部分。
最近有报道称，Paf1、Ctr9、Rtf1和Leo1在缺乏ATP的情况下与蛋白酶体的19S帽相关(53). 然而，在Paf1复合物的质谱分析中，我们没有发现任何蛋白酶体成分。此外，当我们使用19S蛋白酶体成分Sug1和Rpt1的特异性抗体来探测TAP标记的Cdc73组分时，没有发现与Paf1复合物相关的蛋白酶体成分（图。). 因此，报道的Paf1复合物与蛋白酶体的关联可能是这些早期研究中使用的亲和分离的产物。特别是，Rtf1与上述许多亲和矩阵的非特异性关联（图。)可能导致了这些观察结果。使用针对其他几种高分子酵母复合物成分的抗体，我们没有发现纯化的Paf1复合物中存在Spt6、Bur2、Snf12或Caf1的证据（数据未显示）。
Cdc73-TAP与蛋白酶体的成分无关。使用兔IgG琼脂糖珠对Cdc73-TAP菌株的提取物进行亲和纯化。通过添加TEV蛋白酶从树脂中洗脱结合蛋白。洗脱液通过SDS-PAGE溶解，并用蛋白酶体特异性抗体进行免疫印迹。IP，输入；FT，流通；E、 洗脱液。
之间的遗传相互作用PAF1型,RTF1级、和低地球轨道1.
我们之前报道过，尽管PAF1型不是一个必需基因，它的丢失导致许多表型变化，包括生长缓慢；增加对低温和高温、细胞壁损伤剂和羟基脲的敏感性；与野生型细胞相关的异常形态(4,48; Betz等人提交）。删除CTR9号机组产生相同的表型谱(22; Betz等人提交）。损失CDC73型导致更温和的表型变化，通常是所见表型变化的子集paf1Δ(4,47; Betz等人，已提交）。组合aPAF1型删除，删除CDC73型或CTR9号机组不会导致任何表型增强(22,47)这与它们在相同的细胞过程中起作用的事实一致。如果Rtf1和Leo1也参与了相同的细胞过程，那么将这些突变与其他Paf1复合物成分的突变结合不会导致表型增强(14). 因此，我们构建狮子座1Δ和rtf1Δ突变体，并通过与适当的等基因交配，利用这些突变体创建双突变体paf1Δ应变。二倍体被孢子化，四分体被解剖并检测基因型和表型。
中的点突变RTF1级最初被描述为TATA-结合蛋白（TBP）突变的抑制剂(48). 删除RTF1级也抑制TBP的相同等位基因，点突变和缺失都会导致转录起始位点的改变。我们发现了rtf1Δ菌株在30°C的富培养基中生长稍慢于野生型菌株（图。)（倍增时间为97分钟对80分钟），并且在36°C时具有轻微的温度敏感性（图。). 然而，与最近的一份报告相比(8)，我们观察到，酵母遗传背景中Rtf1的缺失并未导致对6-氮杂嘧啶（6AU）的敏感性（数据未显示）。当我们分析几个rtf1Δpaf1Δ双突变体，我们发现Rtf1的缺失显著抑制了许多paf1Δ表型。安rtf1Δpaf1Δ双突变体的生长速度明显快于paf130°C下富介质中的Δ（图。)（145倍于175分钟的倍增时间），尽管比rtf1Δ. 此外，尽管rtf1型Δ单独是轻微的温度敏感性，突变抑制了paf1Δ（图。). Rtf1的损失也恢复了paf1咖啡因和羟基脲的Δ（图。). 我们还发现rtf1Δ与ctr9键Δ（数据未显示）。如前所述(30)，我们发现狮子座1Δ菌株没有表现出任何明显的表型，基本上与野生型一样生长（图。). 然而，我们发现狮子座1Δpaf1Δ双突变体对温度不敏感，对羟基脲的抗性略高于apaf1Δ应变（图。). 因此，去除Rtf1或Leo1可以抑制Paf1损失引起的一些多效性缺陷。
删除RTF1级基因抑制由基因断裂引起的缺陷PAF1型基因。（A） 指示缺失菌株在YPD中30°C下生长的生长曲线。（B） YJJ662（野生型）、YJJ1303的培养物(rtf1Δ::坎第页)、YJJ1326(rtf1Δ::坎第页paf1Δ::HIS3型)、YJJ577(paf1Δ::HIS3型)单元格（约107/ml）在YPD培养基上的10倍系列稀释液中发现，并在30和36°C下生长，在含有4 mM咖啡因和50 mM羟基脲的YPD上生长，并在30C下生长。（C） YJJ662（野生型）、YJJ1336（leo1Δ）、YJ J1361（leo 1Δpaf1Δ）和YJJ577（paf1△）培养物生长在面板B所示的培养基上。培养4天后拍摄平板照片。
Rtf1恢复丢失CLN1型中的表达式paf1Δ.
Paf1缺失导致许多酵母基因表达模式的改变(4,48; Betz等人，已提交）。由于Rtf1的损失并不能完全抑制paf1Δ表型，我们不希望所有转录都恢复到正常水平。然而，由于双突变体的生长速度明显快于paf1Δ应变，我们分析了G的表达水平1细胞周期蛋白CLN1型在这些突变体中。Koch及其同事发现，Paf1和Ctr9是完整表达CLN2型，另一个G1细胞周期蛋白(29)，我们发现Paf1是许多其他细胞周期调控基因正常表达所必需的，包括CLN1型（Betz等人提交）。我们在paf1Δ,CLN1型mRNA减少约三倍，而rtf1Δpaf1Δ应变CLN1型表达恢复到野生型水平（图。). 我们观察到mRNA水平的类似恢复注册号1和CYC1（日历年1）在里面rtf1Δpaf1Δ相对于paf1Δ（数据未显示；E.Amiott，个人通信）。恢复注册号1转录物为抑制羟基脲敏感性提供了潜在的分子解释，如图所示。.事实上rtf1Δ，以及较小程度狮子座1Δ，可以抑制由Paf1缺失引起的转录缺陷，这与部分缺陷的Paf1复合物可能会阻断转录的观点一致，而去除额外的复合物成分可能会缓解这种阻断。
CLN1消息在rtf1型Δpaf1Δ双突变株。所示缺失菌株的重复培养物生长到1.3×10的密度7细胞/ml，收集总RNA，并对每条通道分离15μg RNA。用放射性标记探针检测mRNA水平CLN1型并归一化为材料和方法中所述的18S rRNA。上面板中的条表示下面板中显示的重复样本的平均值。
讨论
酵母细胞含有至少两种复杂形式的RNA Pol II。10%到15%的Pol II与Srb介导因子复合，这种Pol II对大多数（如果不是全部）酵母基因的转录启动以及对许多激活剂和阻遏剂的反应都很重要（参考文献综述34). 在本研究中，我们确定Paf1、Cdc73和Hpr1仅与高分子质量（～1.7-MDa）复合物中约2%的细胞Pol II相关，与Srb-介体不同。虽然Paf1复合物包含一般起始因子TFIIB和TFIIF（图。) (47)发现与Pol II的非磷酸化起始形式有关(57)，尚未确定其作为起始复合体发挥作用。Paf1复合物基因的缺失只会导致一小部分酵母基因的表达改变(4,47; Chang等人，未发表）。这些改变是由于起始阶段的改变还是另一个转录步骤的改变？在这些研究中，我们使用亲和纯化和质谱鉴定了Paf1复合物的三个额外成分：Ctr9、Rtf1和Leo1。这些鉴定表明转录起始和延伸都有新的有趣的联系。
Ctr9，G需要1cyclin表达，是Paf1复合物的一部分。
CTR9号机组，也称为CDP1（CDP1）已在两个遗传筛选中分离出，一个是寻找与着丝粒结合因子的遗传相互作用(10)以及第二次搜索G所需的基因1细胞周期蛋白转录(22). Ctr9缺失导致染色体不稳定(10); 减少G的表达1细胞周期蛋白(21); 生长缓慢；以及对极端温度、羟基脲和许多细胞壁损伤剂（包括咖啡因和十二烷基硫酸钠）的敏感性(21; Betz等人，已提交）。除了尚未测试的染色体不稳定表型外ctr9键Δ由共享paf1Δ. 然而，Paf1的缺失确实会导致重组的增加(4)，这可能与染色体稳定性的丧失有关ctr9型Δ. 喜欢ctr9键Δ,paf1Δ菌株在G的表达上有严重缺陷1细胞周期蛋白CLN1型和CLN2型此外，许多其他细胞周期调控基因的完全表达都需要Paf1，包括总公司和注册号1（波特等人提交）。Paf1对于从蛋白激酶C-有丝分裂原激活的蛋白激酶级联到维持细胞完整性所需的靶基因的信号传递也至关重要(4). 在酵母基因的重要亚群的表达中，对Paf1和Ctr9的要求对于染色体位置的目标基因和各种启动子报告结构都是正确的(4,10,22). 事实上，CTR9号机组最初被确定为G所需的因素1细胞周期调控启动子元件与报告基因融合筛选细胞周期蛋白表达(22). 因此，Paf1和Ctr9通过启动子元件发挥作用，影响正常转录水平，并对细胞周期中的信号和细胞损伤作出反应。
Rtf1对起始点选择和伸长都很重要，也是Paf1复合物的一部分。
RTF1级最初在基因筛查中发现了抑制缺陷型TBP的突变(50). 这个标准件15-122TBP等位基因对TATA盒识别的特异性发生改变，导致转录起始位点的改变(2). 这个rtf1-1等位基因抑制由标准件15-122突变和进一步改变启动位点选择，但不能将起始位点恢复到野生型位置(50). 但是，完全删除RTF1级也会抑制标准件15-122缺陷和恢复野生型起始位点选择(50). 有趣的是，在Paf1复合体中也发现了Ccr4的突变(4)也与TBP和标准件15-122等位基因(三). 基于这些研究，很明显Rtf1，可能是Paf1复合物的一部分，在转录早期起着重要作用。
除了在启动中的作用外，最近有报道称Rtf1还与转录延伸因子有广泛的遗传相互作用(8). 特别地，rtf1型Δ与CTK1型，Pol II CTD激酶(8);飞行控制面板1，一种CTD磷酸酶(8); 和POB3系列，一种染色质重塑因子，在起始和延伸中发挥作用(11). 此外，RTF1级与其他伸长因子（包括TFIIS）发生遗传相互作用(PPR2（PPR2）)和SPT5标准(8). 与SPT5标准由于我们在TAP标记的Cdc73的质谱分析中检测到来自Spt5的肽，并且抗Spt5抗体检测到高分子量Paf1复合物中Spt5大小正确的蛋白质（图。). 此外，Paf1、Cdc73和Rtf1被确定为Spt5相互作用因子（G.Hartzog和K.Arndt，个人沟通）。
就像里面的那些RTF1级，中的突变SPT5标准导致转录起始位点的改变，也对伸长有影响(16,51)和Spt5与Pol II的起始和延伸形式相互作用(26). Spt5和Spt4一起发现于一个复合物中，是Hartzog等人通过生化方法鉴定的人类DSIF转录延伸因子的酵母同源物(16). DSIF延伸因子赋予药物DRB（5,6-二氯-1-β）的敏感性-d日-核糖呋喃氧基苯并咪唑），并被认为在体内的转录延长中起负作用(55). DRB抑制磷酸化Pol II CTD的pTEFb激酶，是体外早期伸长所必需的(31). Spt5和Rtf1影响伸长的一些证据来自突变体的表型分析，特别是任一基因的突变导致对6AU的敏感性(8,16). 然而，6AU敏感性和转录延伸缺陷之间的联系是复杂的。伸长因子TFIIS突变(PPR2（PPR2）)或Rpb1(1)，印尼盾2(42)或9卢比(17)Pol II亚单位导致对6AU的敏感性。在体外，Rpb2的6AU敏感突变体明显存在伸长缺陷。然而，在体内，各种6AU敏感突变体的主要作用似乎是减少聚氨酯5IMP脱氢酶编码基因(17,46). 由于聚氨酯5表达可以通过融合到启动子和5′-非翻译区的报告子结构进行转移聚氨酯5基因(46)目前尚不清楚体内6AU敏感突变对转录的哪个阶段产生影响。
Paf1复合物参与转录延伸吗？尽管paf1Δ菌株生长缓慢，对多种化合物敏感，但对6AU不敏感（Betz等人，提交），尽管是同基因的第2页该菌株受到强烈抑制。此外，rtf1Δ菌株在我们的遗传背景中对6AU不敏感（C.Mueller，未发表）。两者都不是cdc73Δ或高功率1Δ菌株对6AU敏感，尽管ccr4号机组Δ对药物非常敏感(9; Betz等人，提交）和狮子座1Δ稍微敏感（C.米勒，未发表）。如上所述，对6AU的敏感性既不能证明也不能否定蛋白质在伸长中的作用。然而RTF1级和伸长系数(8)事实上，Spt5的同源物DSIF对体外伸长很重要，这是一个有力的证据。
Paf1复合物不是可能跨越起始和延伸界线的唯一因素；许多转录因子似乎在转录的多个阶段发挥作用。GTF TFIIF显然是启动子逃逸和延伸所必需的(44,59)TFIIH在启动和启动子逃逸中的作用可以追溯到其在下游启动子DNA不同区域的作用(49). Pol II的Rpb9亚基突变揭示了对两个起始位点选择的影响(12)和伸长率(17). 此外，Pob3-Spt16染色质重塑复合物与RTF1型(8)对转录的起始和延伸也很重要(11). 由于起始、启动子清除和伸长率的进入显然是一个多步骤的过程(39)也许这并不奇怪，如此多的因素似乎参与了这一关键的转变。然而，Paf1复合物在伸长中的中心作用与Paf1或其他复合成分的丢失仅影响一小部分基因的表达这一事实并不一致。此外，我们观察到Paf1和Rtf1的缺失使细胞恢复到接近野生型表型，这并不支持Paf1复合物可能是所有酵母基因伸长所必需的概念。相反，我们的结果符合一个模型，其中Paf1复合物在一小部分启动子中发挥作用，以增强对信号通路（即蛋白激酶C、细胞周期）的响应。复合物中的部分缺陷，如Paf1或Ctr9的缺失，可能导致有缺陷的复合物阻断转录。去除第二组分，如Rtf1，可能会释放被阻断的复合体，并允许恢复到几乎正常的转录模式，这可能是通过Pol II的Srb-介体形式的作用实现的。测试该模型需要确定Paf1复合物的主要基因靶点。
