《分子医学杂志》（柏林）。2018; 96(3): 301–313.
TGF-β诱导的NKILA通过NF-κB/MMP14信号通路抑制ESCC细胞迁移和侵袭
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1和1 吕志良
1中华人民共和国北京市潘家园南里17号中国医学科学院协和医学院国家癌症中心/肿瘤医院胸外科，邮编：100021
陈兆丽（Zhaoli Chen）
1中华人民共和国北京市潘家园南里17号中国医学科学院肿瘤医院国家癌症中心胸外科
袁丽（音）
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王静楠
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张志荣
2首都医科大学北京朝阳医院胸外科，北京，100020
云车
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黄建兵
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孙寿国
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双双毛
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袁元雷
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高一波
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杰和
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1中华人民共和国北京市潘家园南里17号中国医学科学院肿瘤医院国家癌症中心胸外科
2首都医科大学朝阳医院胸外科，北京，100020
通讯作者。 2017年9月3日收到；2017年11月27日修订；2018年1月15日接受。
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摘要
摘要
转化生长因子β（TGF-β）信号通路在绝大多数癌症中发挥抗肿瘤和促肿瘤作用，而长时间非编码RNA已被报道在高度关联反应过程中发挥关键作用。然而，长链非编码RNA（lncRNA）在食管鳞状细胞癌（ESCC）TGF-β信号传导中的作用尚不清楚。在本研究中，我们通过RNA-seq来比较TGF-β1处理和未处理的ESCC细胞之间lncRNA的表达水平，并观察到NF-kappaB-interacting lncRNA（NKILA）被经典的TGF-？信号通路显著上调。使用RT-qPCR对39对食管鳞癌和邻近非肿瘤样本进行RNA分析表明，与早期（I和II）相比，NKILA在食管鳞癌肿瘤组织中的表达水平显著下调，晚期肿瘤组织（III和IV）中的NKILA表达水平显著降低(第页 < 0.01). 获得和丧失功能的实验表明，NKILA在体内外抑制ESCC细胞的转移，机制研究表明NKILA通过抑制IκBα磷酸化和NF-κB活化来抑制MMP14的表达。总之，这些发现表明TGF-β诱导的lncRNA NKILA具有抗转移治疗的潜力。
关键信息
经典TGF-β信号通路可显著上调ESCC中长非编码RNA NKILA的表达。
NKILA在食管鳞癌中显著下调，并与TNM分期呈负相关。
NKILA通过抑制IκBα的磷酸化和NF-κB的活化来抑制MMP14的表达，从而抑制ESCC细胞的转移。
电子辅助材料
本文的在线版本（10.1007/s00109-018-1621-1）包含补充材料，可供授权用户使用。
关键词：NF-kappaB相互作用lncRNA，转化生长因子β，长非编码RNA，肿瘤转移，ESCC
介绍
食管癌是全世界癌症相关死亡的主要原因之一，其中一半的病例发生在中国[1]. 在中国和世界范围内大约90%的食管癌病例是鳞状细胞癌[2–4]. 该病的总体5年生存率仅为15%至25%，食管癌的不良预后与受累患者的转移期诊断有关，即使是肿瘤表面较浅的患者[5]. 介导转移级联反应的分子机制目前尚不清楚。提高对癌症进展和转移的分子机制的理解，可能会加速食管鳞癌（ESCC）患者有效转移靶向治疗的发展。
多功能细胞因子TGF-β协调复杂且依赖于环境的信号网络，以调节肿瘤发生和疾病进展。TGF-β途径可通过失活该途径的核心成分，如TGF-？受体，或通过诱导下游改变而仅使该途径的抑瘤臂失效，从而促进早期肿瘤的细胞周期阻滞和凋亡，但在晚期疾病中可促进肿瘤的进展和转移[6–8]. 转化生长因子-β诱导的上皮-间充质转化（EMT）在肿瘤细胞转移中的作用已被证实；然而，EMT及其相反过程间质上皮转化（MET）在肿瘤细胞转移中的必要性仍存在激烈争论[9–11]. 迫切需要更好地了解TGF-β信号传导的特异性和时间依赖性下游效应器，以加快靶向TGF-α信号通路治疗的发展。
长非编码RNA（lncRNAs）是一类长度超过200个核苷酸的转录物，似乎没有编码潜力[12,13]. 最近的许多研究表明，lncRNA在一系列癌症中经常失调，并参与多种生物学过程，如细胞周期进展、细胞凋亡和细胞转移[14,15]. 迄今为止，lncRNA发挥其功能的确切机制尚不清楚；然而，大多数lncRNAs似乎通过调节癌症中的重要信号通路来执行其生物功能，例如TGF-β信号通路，这是最重要的癌症细胞信号通路之一[15]. 例如，lncRNA-ATB（一种由TGF-β激活的lncRNA）通过与miR-200竞争性结合并稳定IL-11 mRNA，促进侵袭转移级联活性和器官定植[16]. 在本研究中，我们发现NF-kappaB-interacting lncRNA（NKILA）被TGF-β1显著上调，并关注NKILA在TGF-α信号传导和侵袭转移级联中的作用。
材料和方法
组织样本和临床数据收集
从中国医学科学院肿瘤医院胸外科获得39个ESCC组织和一对匹配的相邻正常食管组织（术后收集，时间为2008年4月至2009年6月）。对这39例患者进行了病理诊断。所有患者在手术前均未接受放疗或化疗，也未在手术前3年内诊断出任何其他癌症。根据美国癌症联合委员会TNM分期系统（第7版）对ESCC患者进行分期，并收集与这些患者的临床病理特征相关的数据。这39名患者的肿瘤组织和邻近正常组织在切除后立即在液氮中进行snap冷冻，并在本研究中使用之前保存在−80°C下。
细胞培养与稳定细胞系构建
本研究共使用了7种细胞系，包括6种ESCC细胞系（KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE280、KYSA450和KYSE510）和永生化正常人食管上皮细胞系Het-1a。细胞系如前所述进行培养[17]. 我们通过将每个细胞系的短串联重复序列（STR）剖面与DSMZ在线STR数据库中的注册信息相匹配来确认细胞系身份。TNF-α和IL-1β购自Peprotech（美国），使用浓度为10ng/ml，TGF-β1购自R&D（美国），使用浓度为5ng/ml。除非另有规定，否则治疗时间为24小时。为了抑制TGF-β和NF-κB信号传导，我们在指定治疗前30分钟向细胞培养基中添加10μM JSH-23（美国塞莱克）或5μM SB505124（美国塞勒克）。
全长NKILA cDNA由Generay（中国上海）合成并连接成pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro（CD513B-1）载体。从OBiO（中国上海）获得了非靶向对照shRNA和两个针对NKILA的shRNA（分别为sh1和sh2）。如前所述进行转染和慢病毒包装[17].
转录组的下一代测序
用或不用5 ng/ml重组TGF-β1处理KYSE30和KYSE180细胞72小时。然后从处理和未处理的KYSE30和KYSE180细胞中提取总RNA。有关样品制备、文库制备和测序的详细信息，请参阅补充资料。基因表达水平根据FPKM（每千碱基片段数/百万读）值确定。我们使用≥2.0的倍数变化作为筛选上调和下调lncRNAs或mRNAs的阈值。
RNA提取、RT-qPCR、western blotting和transwell分析
如前所述进行RNA提取、RT-qPCR、western blotting和transwell分析[18]. 以下抗体用于western blot分析：GAPDH（CST）、p65（CST。用于PCR的引物和研究中使用的shRNA序列如表S所示1。
染色质免疫沉淀（ChIP）分析
根据制造商的说明，使用经PBS或重组TGF-β1处理30分钟的KYSE30细胞，使用抗Smad2/3抗体（CST）和EZ-Magna ChIP染色质免疫沉淀试剂盒（Millipore）进行ChIP分析。利用针对NKILA启动子区的特异性引物，通过qRT-PCR分析ChIP分离的染色质部分。利用JASPAR预测Smad2/3结合基序(网址：http://jaspar.genereg.net/). ChIP-qPCR引物如表S所示1。
肺定植试验
雌性SCID-米色小鼠（4-5周龄）用于动物研究。40只小鼠分为四组（每组10只），给予尾静脉注射1×106含有不同质粒（载体、NKILA、shvec和sh1）的KYSE30细胞。七周后，用一氧化碳处死小鼠2麻醉后，将切除的组织用苦味酸浸泡并包埋在石蜡中进行苏木精和伊红（H&E）染色，然后计算其肺部肿瘤结节的数量。
统计分析
使用SPSS 20.0版（SPSS，芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行统计分析。采用卡方检验分析NKILA表达水平与患者临床病理特征之间的关系。Mann–Whitney评估了实验组之间NKILA表达的差异U型通过Wilcoxon配对符号秩检验评估肿瘤和配对非肿瘤组织之间NKILA表达的差异。细胞实验的结果以三个独立实验的平均值和SD表示，各组之间的差异通过独立样本Student’st吨测试。差异被认为在第页 < 0.05.
结果
转化生长因子β上调LncRNA NKILA
为了鉴定受TGF-β调节的lncRNAs并介导TGF-？对细胞转移的调节作用，我们用TGF-α1连续治疗KYSE30和KYSE180 ESCC细胞72h。根据我们随后观察到的细胞呈纺锤状外观（图S），治疗使细胞经历EMT1A） 以及促进细胞迁移和侵袭，如伤口愈合所示（图S1B） 和变速箱（图S1C和D）测定。然后，我们使用全转录RNA-seq比较TGF-β1处理和未处理细胞系之间的mRNA和lncRNA表达水平。我们发现，与相应的未处理细胞相比，TGF-β1处理的KYSE30和KYSE180细胞中有249个mRNA上调，468个mRNA下调（图a） ●●●●。RNA-seq结果表明TGF-β1治疗导致EMT基因表达特征，间充质标志物高表达，上皮标志物低表达（图。b） ●●●●。为了评估RNA-seq的准确性，我们通过RT-qPCR（图。c） ●●●●。功能分组网络[19]丰富的KEGG通路和GO生物功能术语表明，许多TGF-β响应信号通路和生物过程在TGF-？处理的细胞系中显著富集（图。d和图S2)，证实RNA-Seq结果是可靠的。
在KYSE30和KYSE180细胞中TGF-β诱导的EMT标记物。一RNA-seq显示，KYSE30和KYSE180细胞经TGF-β处理或不处理后差异表达的mRNA的文氏图。b条与用TGF-β1处理72 h的KYSE30和KYSE180细胞和对照细胞中EMT相关基因表达水平有关的RNA-seq数据的热图表示。c（c）RT-qPCR显示了用TGF-β1处理72 h的KYSE30和KYSE180细胞和对照细胞中EMT相关基因表达的热图。d日功能分组网络，其中丰富的KEGG通路和GO生物功能项作为基于kappa评分水平（≥0.55）的连接节点。只显示每组中最重要术语的标签。通过Cytoscape Cluego插件丰富了KEGG通路和GO生物功能术语。八角体代表KEGG途径。椭圆表示GO项。节点大小表示术语充实的重要性；因此，节点大小越大，校正后的值就越小第页值。不同的颜色代表不同的功能组
我们发现与相应的未处理细胞系相比，TGF-β1处理的两种细胞系中有167个lncRNA上调，290个lnc RNA下调（图a） ●●●●。然后，我们将研究范围限定为FPKM值≥1且表达水平在处理细胞和未处理细胞之间差异大于4.0倍的lncRNAs。与未经处理的细胞相比，我们鉴定了7个表达上调的lncRNA和4个表达下调的lncRNAs，并通过RT-qPCR验证了大多数lncRNA的表达（图。b） ●●●●。在这些lncRNA中，在TGF-β1处理的细胞中表达上调最多的lncRNA是lncRNA NKILA（图。b） 与相应的未经处理的细胞系相比，其在两种ESCC细胞系中的表达上调了10倍以上（图。c） ●●●●。在KYSE30和KYSE180细胞中，NKILA的表达在TGF-β1治疗后24小时达到峰值，治疗后96小时内保持升高（图。d） ●●●●。NKILA是由染色体20q13上的一个基因编码的lncRNA，最初被鉴定为乳腺癌中NF-κB诱导的lncRNA[20]. 为了确定TGF-β信号是否与NKILA表达有关，我们使用TGF-α受体抑制剂SB505124和NF-κB核转位抑制剂JSH-23消除TGF-γ1治疗对NKILA的影响。结果表明，SB505124完全抑制了TGF-β1诱导的KYSE30和KYSE180细胞中NKILA的表达，但不抑制JSH-23（图。e） 。
NKILA受经典TGF-β途径上调。一RNA-seq显示，KYSE30和KYSE180细胞经TGF-β处理或不处理后差异表达的lncRNAs的文氏图。b条RT-qPCR验证了RNA-seq检测到的前11个差异表达lncRNAs在经TGF-β1处理72h的KYSE30和KYSE180细胞和对照细胞中的表达水平。c（c）用qRT-PCR测定KYSE30或KYSE180细胞中NKILA的相对表达水平（用或不用TGF-β1处理）。d日TGF-β1刺激后KYSE30和KYSE180细胞中NKILA表达动力学。电子如qRT-PCR所示，在KYSE30和KYSE180细胞中，经TGF-β1和有或无TGF-α抑制剂SB505124（SB）或NF-κB抑制剂JSH-23（JSH）处理的NKILA表达。（f）根据ChIP分析测定，Smad2/3复合物定位于经TGF-β1或PBS处理30分钟的KYSE30细胞中的NKILA启动子。克亚细胞定位，如RT-qPCR评估，表明NKILA在细胞核和细胞质中表达。GAPDH和NEAT1 RNA被用作分级指标。数据显示为平均值±SD；n个 = 3. ***第页 < 0.001，ns表示无显著差异（学生t吨测试）
为了研究NKILA是否受经典TGF-β途径调节，我们使用抗Smad2/3抗体进行了ChIP分析。我们发现TGF-β1处理导致丰富的NKILA启动子序列显著增加，这意味着Smad2/3复合物通过TGF-。f） ●●●●。我们还观察到Smad3磷酸化选择性抑制剂SIS3可以恢复TGFβ诱导的NKILA表达（图S三). 此外，细胞核和胞质部分分离研究以及RT-qPCR表明，NKILA在KYSE30和KYSE180细胞的细胞核和细胞质中同时表达，这一结果与之前关于乳腺癌中NKILA表达的报道不一致，可能是由于NKILA调节的细胞特异性差异所致。GAPDH和核酸NEAT1被用作分级指标（图。g） ●●●●。综上所述，这些结果表明，在ESCC细胞中，NKILA被经典的TGF-β信号通路显著上调。
NKILA在体外负调控肿瘤的迁移和侵袭
鉴于NKILA参与TGF-β信号转导，在细胞迁移和侵袭中发挥重要作用，我们推测NKILA在肿瘤转移中起重要作用。首先，我们生成了两个NKILA敲除质粒（分别命名为sh1和sh2），并通过RT-qPCR评估了质粒敲除NKILA表达的效率。无论是否用TGF-β1处理细胞，两个敲除细胞克隆均显示NKILA表达减少70%以上（图a、 b）。然后，我们通过跨阱分析研究NKILA表达对ESCC细胞恶性行为的影响。如图所示。c、 当NKILA表达水平降低时，KYSE30和KYSE180细胞的迁移和侵袭能力显著增强。相反，与转染模拟车辆对照组的细胞相比，NKILA过表达稳定的KYSE30和KYSE180细胞中NKILA表达显著增加（图。e、 f）。此外，NKILA过度表达显著抑制了两种ESCC细胞系的迁移和侵袭能力（图。g、 h）。
NKILA在体外负调控细胞迁移和侵袭。一,b条NKILA在稳定敲除细胞克隆中的表达。c（c）,d日指示的KYSE30细胞克隆(c（c）)或KYSE180细胞克隆(d日)添加到涂有或不涂有Matrigel的transwell仪器顶部。24小时后计算每个场迁移或入侵细胞的数量。电子,（f）NKILA在稳定的NKILA过表达或模拟车辆对照转染的KYSE30和KYSE180细胞克隆中的表达。克,小时过度表达KYSE30的NKILA的迁移和入侵能力(克)和KYSE180(小时)用transwell法检测细胞和模拟病毒对照转染细胞。比较各组间迁移细胞和侵入细胞的数量。数据显示为平均值±SD，n个 = 3. *第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001（学生的t吨测试）
NKILA抑制体内肿瘤转移
为了进一步评估NKILA表达对ESCC细胞体内转移的影响，我们通过将细胞直接注射到非肥胖糖尿病（NOD）-SCID小鼠的尾静脉来进行肺定植试验。尾静脉注射7周后，统计肺部转移结节的数量。NKILA过表达细胞的肺定植率降低，在肺中形成的转移性肿瘤较少，而与模拟载体对照转染的细胞相比，NKILA敲低细胞的转移性结节形成显著增加（图a、 b）。从小鼠分离的肺组织的H&E染色图像如图所示。c.这些数据表明NKILA抑制体内肿瘤转移。
NKILA与体内恶性进展呈负相关。一显示了各组分离肺的代表性图像。b条肺转移结节的数量一尾静脉注射后7周进行计数。c（c）显示了各组H&E染色肺切片的代表性图像。d日39例ESCC患者肿瘤组织和邻近正常组织中NKILA的相对表达水平如log所示2(T型/N个)=对数2(T型NKILA公司/N个NKILA公司). 每一列代表一名患者。电子NKILA表达（2-ΔCT)将39例肿瘤组织与配对的非癌肺组织进行比较。（f）比较14例早期（I和II）疾病患者和25例晚期（III和IV）疾病患者的NKILA表达水平。数据显示为具有四分位范围的中位数，以及Mann–WhitneyU型使用了测试。克食管上皮细胞系Het-1a和6个ESCC细胞系中NKILA的表达水平。GAPDH是装载控制。数据显示为平均值±SD，n个 = 3. **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001（学生的t吨测试）
食管鳞癌患者肿瘤组织中NKILA下调
采用RT-qPCR方法检测39例食管鳞癌患者肿瘤组织和匹配的邻近正常组织中NKILA的表达水平，结果表明，与邻近正常食管组织相比，食管鳞癌组织中NJILA的表达显著降低(第页 < 0.001，图。d、 e）。此外，与早期肿瘤组织相比，晚期肿瘤组织中NKILA的表达水平显著降低(第页 < 0.01，图。f） ●●●●。NKILA在有淋巴结转移的肿瘤组织中的表达也低于无淋巴结转移肿瘤组织，但两组之间的差异不显著(第页=======================================================================0.076，图S4)可能是因为样本的大小很小。根据NKILA在肿瘤组织中的表达水平，39例ESCC患者被分为以下两组：NKILA高表达组(n个 = 19，NKILA表达水平>中位数表达水平）和低NKILA表现组(n个==================================================================================17，NKILA表达水平≤中位水平）。ESCC中NKILA下调与T型阶段(第页 < 0.05）和临床分期（p<0.05）。然而，NKILA的表达与年龄、性别、吸烟、病理分级和肿瘤大小无关(第页 > 0.05）（表S2). 此外，与人类食管上皮细胞系Het-1a相比，上述六种ESCC细胞系中的NKILA表达显著下调（图。g） ●●●●。所有这些数据表明，NKILA在ESCC肿瘤组织中的表达显著下调，并与NKLIA在ESCC肿瘤发生和发展中有关。
NKILA抑制ESCC细胞IκBα磷酸化和NF-κB活化
据报道，NKILA与乳腺癌中NF-κB信号的激活相互作用并影响其活性[20]. 我们在NKILA过度表达和沉默的ESCC细胞中检测到IκBα和p65磷酸化水平，发现TNF-α诱导的IκB-α和p65-磷酸化被KYSE30和KYSE180细胞中的异位NKILA表达所抑制，但在两种细胞系中NKLIA沉默会增强（图a、 b）。此外，我们发现，与模拟病毒对照转染细胞相比，异位NKILA表达显著抑制了TNF-α诱导的KYSE30和KYSE180细胞中p65核移位，而NKILA沉默显著延长了KYSE20和KYSE280细胞中的p65移位（至24小时），结果与上述结果一致（图。c、 d）。这些结果表明，NKILA通过抑制IKK诱导的IκBα磷酸化来抑制NF-κB的活化。
NKILA通过NF-κB/MMP14信号通路抑制ESCC细胞迁移和侵袭
基质金属蛋白酶（MMPs），在细胞外基质周转和癌细胞迁移和侵袭中起核心作用[21]，是NF-κB诱导的细胞转移的最重要的下游调节因子之一。为了确定NKILA如何调节细胞迁移和侵袭，我们检测了NKILA过度表达或沉默的ESCC细胞中MMP2、MMP9和MMP14蛋白的表达水平。我们发现MMP14的表达水平因异位NKILA表达而显著减弱。相反，沉默NKILA提高了KYSE30和KYSE180细胞中MMP14的表达水平（图。a、 b）。此外，NF-κB转位抑制剂JSH-23完全消除了NKILA诱导的MMP14表达水平的变化（图S5). 巧合的是，我们的mRNA微阵列数据[22]与119例食管鳞癌患者的切除组织有关（图。e） ，华苏收集的微阵列数据[23]（图。f） 和来自TCGA的ESCC RNA-seq数据（图。g） 结果表明，与配对正常组织相比，食管鳞癌组织中MMP14的表达显著上调。为了确定NF-κB/MMP14信号转导是否与NKILA调节的细胞迁移和侵袭有关，我们使用TNF-α诱导NFκB通路激活，从而促进KYSE30和KYSE180细胞迁移和浸润。结果表明，NKILA过度表达导致的迁移和侵袭能力下降被TNF-α刺激所逆转（图a、 b）。相反，NF-κB转位抑制剂JSH-23消除了NKILA沉默诱导的细胞迁移和侵袭能力增强（图。c、 d）。总之，所有这些结果表明NKILA通过NF-κB/MMP14信号传导调节ESCC细胞的迁移和侵袭。
NKILA通过NF-κB/MMP14途径调节ESCC细胞的迁移和侵袭。一,b条用Chamber试验测定经TNF-α或不经TNF--α治疗后稳定表达NKILA或模拟车辆对照的KYSE30和KYSE180细胞的迁移和侵袭。电子,（f）通过Chamber试验测定暴露于TNF-α并用或不用JSH-23（JSH）处理的稳定KYSE30和KYSE180 NKILA敲除或模拟车辆对照细胞克隆的迁移和侵袭。左侧面板具有代表性图像，右侧面板具有统计图。数据显示为平均值±SD，n个 = 3*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001（学生的t吨测试）
讨论
大量研究发现，TGF-β信号通路在调节细胞外基质（ECM）生成和肿瘤转移中起着重要作用；然而，其作用机制尚不清楚。近年来，越来越多的lncRNAs被发现参与各种癌症中TGF-β信号通路[24]并补充TGF-β信号传导调节癌症发展和进展的复杂生物学机制。TGF-β信号传导在ESCC的发生和发展中起着关键作用，TGF-β反应的输出具有高度的相关性。鉴于据报道参与ESCC的lncRNA数量不断增加[25–29]我们推测lncRNA也可能参与TGF-β信号通路。在我们的研究中，我们发现TGF-β1通过RNA-seq在KYSE30和KYSE180 ESCC细胞中显著诱导了lncRNA NKILA，这一发现通过RT-qPCR得到了验证。据报道，乳腺癌中NKILA被TNF-α和IL-1β诱导的NF-κB活化上调了12倍以上[20]. 然而，在本研究中，经TNF-α或IL-1β处理的ESCC细胞中，NKILA表达水平仅增加了一倍。更重要的是，NF-κB核转位抑制剂JSH-23不能逆转TGF-β1诱导的NKILA表达，而TNF-α或IL1β诱导的NJILA上调被TGF-α受体抑制剂SB505124完全抑制（图S6). 根据这些结果以及ChIP化验结果，如图所示。f、 我们得出结论，NKILA被TGF-β经典信号通路直接上调，这表明NKILA可能参与ESCC细胞中TGF-α信号通路。我们进行了功能丧失和获得分析，以研究NKILA在肿瘤细胞恶性行为中的作用。结果表明，NKILA在体外可抑制ESCC细胞的迁移和侵袭，在体内可抑制肺定植。此外，与邻近的非癌组织相比，鳞癌组织中NKILA的表达水平显著降低，与TNM分期和淋巴结转移呈负相关（无统计学意义）。这些发现表明NKILA参与TGF-β信号转导，并在ESCC中发挥肿瘤抑制作用。
转移是癌症患者死亡的主要原因。侵入性细胞通过组织屏障迁移需要ECM的细胞周重塑，这是一个由细胞表面蛋白酶，特别是基质金属蛋白酶执行的过程。一些ECM降解蛋白水解酶，如MMP-1、2、13和14以及组织蛋白酶B、K和L，参与了这一过程；然而，MMP-14可能是胶原蛋白周转中的关键酶和限速酶[21,30,31]. 以前的研究和我们的微阵列数据表明，基质金属蛋白酶14在食管鳞癌组织中的表达上调，与预后不良有关[32–36]，这些发现至少部分归因于基质金属蛋白酶14在ESCC细胞中的转移促进功能。在本研究中，我们发现NKILA通过介导IκBα磷酸化和NF-κB向细胞核移位来降低MMP14的表达水平，从而削弱ESCC细胞的迁移和侵袭能力。此外，NF-κB转位抑制剂JSH-23在KYSE30和KYSE180细胞中消除了NKILA对MMP14表达和ESCC细胞转移潜能的影响。总之，这些发现表明NKILA调节的迁移和侵袭是通过ESCC细胞中的NF-κB/MMP14信号通路介导的。
TGF-β可由肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、癌症相关成纤维细胞（CAFS）以及癌细胞分泌，在许多肿瘤中具有组成型活性[37]. 越来越多的研究已经证实TGF-β途径是癌症发展的一个重要因素，并根据不同配体的浓度发挥抑瘤或促瘤作用。TGF-β信号通路活性持续时间和强度是TGF-α家族成员生物反应的关键决定因素[38,39]. TGF-β途径的几个负调控因子，例如前列腺跨膜蛋白雄激素诱导1（PMEPA1）[40]和血小板反应蛋白-1（THBS1）[41,42]、某些I-Smad（即Smad6和Smad7）、Smad泛素化调节因子（Smurfs）[43]，和TG相互作用因子（TGIF）[44]，已被证明是肿瘤抑制剂。其中许多调节因子由TGF-β转录，但参与负反馈回路，以防止TGF-α途径持续或过度激活。我们发现，NKILA，一种TGF-β诱导的lncRNA，也参与这些负反馈网络，并通过抑制ESCC的进展和转移发挥肿瘤抑制作用。在本研究中，我们发现NKILA在晚期ESCC肿瘤组织中的表达降低，NKILA抑制了体内外ESCC细胞的转移，从而补充了TGF-β信号调节肿瘤进展和转移的复杂网络。
总之，我们的研究表明，NKILA作用于TGF-β信号通路的下游，通过抑制IκBα磷酸化和NF-κB活化来抑制细胞侵袭和转移，从而抑制MMP14的表达。此外，在ESCC患者的晚期肿瘤组织中，NKILA表达水平降低。需要更多样本来评估NKILA在ESCC中的作用，以确定其临床价值。本文讨论的观察结果表明，NKILA有潜力成为治疗ESCC的靶点。
鸣谢
本研究得到了国家自然科学基金[批准号81502060]、国家重点研发计划[批准号2016YFC1303201、2016YFC 0901401]、机构基础研究基金（批准号JK2014B14、2017PT32001）和CAMS创新医学倡议（CIFMS）的支持（批准号：2017-I2M-1-005）。我们感谢孙楠博士、周芳女士和熊美华女士的行政帮助。我们感谢《美国期刊专家》的编辑协助。
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研究方案符合《赫尔辛基宣言》规定的标准，并经国家癌症中心/癌症医院伦理委员会、中国医学科学院和北京协和医学院（中国北京）批准。动物研究由中国医学科学院肿瘤研究所和医院动物护理和使用委员会（NCC2016A088）批准。
脚注
电子辅助材料
本文的在线版本（10.1007/s00109-018-1621-1）包含补充材料，可供授权用户使用。
参与者信息
高一波，电话：+86-10-87788863，电子邮件：nc.ca.smacic@obiyoag公司。
何杰，电话：+86-10-87788863，电子邮件：moc.liamg@eheij.forp。
工具书类
1Torre LA、Bray F、Siegel RL、Ferlay J、Lorte-Tieunt J、Jemal A.2012年全球癌症统计。CA癌症临床杂志。2015;65(2):87–108. doi:10.3322/caac.21262。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 2Rustgi AK，El Serag HB。食管癌。新英格兰医学杂志。2014年；371(26):2499–2509. doi:10.1056/NEJMra1314530。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 三。何云天，李德杰，梁迪，金杰，文DG，陈伟强，何杰。2013年中国食管癌发病率和死亡率估计。中华肿瘤杂志2017年；39(4):315–320.[公共医学][谷歌学者] 4Chen W，Zheng R，Baade PD，Zhang S，Zeng H，Bray F，Jemal A，Yu XQ，He J.《中国癌症统计》，2015年。CA癌症临床杂志。2016;66(2):115–132. doi:10.3322/caac.21338。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 5Pennathur A、Gibson MK、Jobe BA、Luketich JD。食管癌。柳叶刀。2013;381(9864):400–412. doi:10.1016/S0140-6736（12）60643-6。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 6Padua D，Massague J.转化生长因子β在转移中的作用。细胞研究。2009;19(1):89–102. doi:10.1038/cr.2008.316。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 7Massague J.TGFbeta在癌症中的应用。单元格。2008;134(2):215–230. doi:10.1016/j.cell.2008.07.001。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 8Neuzillet C、Tijeras-Raballand A、Cohen R、Cros J、Faivre S、Raymond E、de Gramont A。针对TGF-β途径进行癌症治疗。药物治疗学。2015;147:22–31. doi:10.1016/j.pharmthera.2014.11.001。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 9Fischer KR、Durrans A、Lee S、Sheng J、Li F、Wong ST、Choi H、El Rayes T、Ryu S、Troeger J等。肺转移不需要上皮-间质转化，但有助于化疗耐药。自然。2015;527(7579):472–476. doi:10.1038/nature15748。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 10Zheng X，Carstens JL，Kim J，Scheible M，Kaye J，Sugimoto H，Wu CC，LeBleu VS，Kalluri R.上皮-间质转化对胰腺癌的转移是不必要的，但会诱导化疗耐药。自然。2015;527(7579):525–530. doi:10.1038/nature16064。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 11Maheswaran S，Haber DA。细胞命运：转变失去其侵袭边缘。自然。2015;527(7579):452–453. doi:10.1038/nature16313。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 12Rinn JL，Chang HY。长非编码RNA对基因组的调控。生物化学年度收益。2012;81(1):145–166. doi:10.1146/annurev-biochem-051410-092902。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 13Quinn JJ，Chang HY。长非编码RNA生物发生和功能的独特特征。Nat Rev基因。2016;17(1):47–62. doi:10.1038/nrg.2015.10。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 14Huarte M.lncRNAs在癌症中的新作用。自然医学。2015;21（11） ：1253–1261。doi:10.1038/nm.3981。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 15Schmitt AM，Chang HY。癌症途径中的长非编码RNA。癌细胞。2016;29(4):452–463. doi:10.1016/j.cell.2016.03.010。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 16袁建华，杨凤，王凤，马JZ，郭勇军，陶秋芳，刘凤，潘伟，王太特，周CC，等。TGF-β激活的长非编码RNA促进肝细胞癌的侵袭-转移级联。癌细胞。2014年；25(5):666–681. doi:10.1016/j.ccr.2014.03.010。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 17高玉斌、陈振林、李继刚、胡晓东、石晓杰、孙志明、张飞、赵志荣、李梓、刘志勇、赵义德、孙杰、周CC、姚R、王SY、王鹏、孙恩、张波海、董JS、于毅、罗M、冯XL、石石生、周飞、谭福伟、邱B、李恩、邵K、张丽杰、张丽洁、薛Q、高世光、何杰。食管鳞癌的遗传景观。自然遗传学。2014年；46（10） ：1097–1102。doi:10.1038/ng.3076。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 18Lu Z，Li Y，Wang J，Che Y，Sun S，Huang J，Chen Z，He J.Long非编码RNA NKILA通过NF-kappaB/snail途径抑制非小细胞肺癌的迁移和侵袭。实验性临床癌症研究杂志：CR。2017年；36(1):54. doi:10.1186/s13046-017-0518-0。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 19Bindea G、Mlecnik B、Hackl H、Charoentong P、Tosolini M、Kirilovsky A、Fridman WH、Pages F、Trajanoski Z、Galon J.ClueGO：一种细胞景观插件，用于破译功能分组的基因本体论和路径注释网络。生物信息学。2009;25(8):1091–1093. doi:10.1093/bioinformatics/btp101。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 20Liu B，Sun L，Liu Q，Gong C，Yao Y，Lv X，Lin L，Yao H，Su F，Li D，Zeng M，Song E.一种与长非编码RNA相互作用的NF-kappaB细胞质阻断IkapaB磷酸化并抑制乳腺癌转移。癌细胞。2015;27(3):370–381. doi:10.1016/j.cell.2015.02.004。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 21Kessenbrock K，Plaks V，Werb Z。基质金属蛋白酶：肿瘤微环境的调节器。单元格。2010;141(1):52–67. doi:10.1016/j.cell.2010.03.015。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 22Li J，Chen Z，Tian L，Zhou C，He MY，Gao Y，Wang S，Zhow F，Shi S，Feng X，Sun N，Liu Z，Skogerboe G，Dong J，Yao R，Zhao Y，Sun J，Zhang B，Yu Y，Shi X，Luo M，Shao K，Li N，Qiu B，Tan F，Chen R，He J.LncRNA谱研究揭示了与食管鳞癌患者生存相关的三个ncRNA特征。内脏。2014年；63(11):1700–1710. doi:10.1136/gutjnl-2013-305806。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 23Su H，Hu N，Yang HH，Wang C，Takikita M，Wang QH，Giffen C，Clifford R，Hewitt SM，Shou JZ，Goldstein AM，Lee MP，Taylor PR。食管鳞癌的全球基因表达谱分析和验证及其与临床表型的关系。临床癌症研究。2011;17(9):2955–2966. doi:10.1158/1078-0432.CCR-10-2724。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 24王杰，邵恩，丁X，谭B，宋Q，王N，贾Y，凌H，程Y。转化生长因子-β信号通路和长非编码RNA在癌症中的相互作用。癌症快报。2015;370(2):296–301. doi:10.1016/j.canlet.2015.11.007。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 25王CM、吴庆群、李斯庆、陈福杰、拓力、谢慧华、童YS、纪力、周国忠、曹庚、吴敏、吕杰、史伟、曹芳。长非编码RNA PlncRNA-1的上调促进食管鳞癌细胞增殖，并与晚期临床分期相关。挖掘与疾病科学。2014年；59(3):591–597. doi:10.1007/s10620-013-2956-7。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 26李伟，郑杰，邓杰，尤英，吴华，李恩，卢杰，周勇。长基因间非蛋白编码RNA POU3F3水平升高促进食管鳞癌细胞DNA甲基化。胃肠病学。2014年；146：1714–1726。doi:10.1053/j.gastro.2014.03.002。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 27Wu W，Bhagat TD，Yang X，Song JH，Cheng Y，Agarwal R，Abraham JM，Ibrahim S，Bartenstein M，Hussain Z等。Barrett食管和食管腺癌中非编码DNA区域的低甲基化和长非编码RNA AFAP1-AS1的过表达。胃肠病学。2013;144:956–966. doi:10.1053/j.gastro.2013.01.019。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 28Yang X、Song JH、Cheng Y、Wu W、Bhagat T、Yu Y、Abraham JM、Ibrahim S、Ravich W、Roland BC、Khashab M、Singh VK、Shin EJ、Yang X，Verma AK、Meltzer SJ、Mori Y.Long非编码RNA HNF1A-AS1调节食管腺癌细胞的增殖和迁移。内脏。2014年；63(6):881–890. doi:10.1136/gutjnl-2013-305266。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 29陈福杰、孙明、李斯庆、吴庆群、纪立、刘志力、周国忠、曹庚、金磊、谢慧慧、王CM、吕J、德伟、吴明、曹XF。长非编码RNA热空气的上调促进食管鳞状细胞癌的转移和不良预后。霉菌致癌。2013;52(11):908–915. doi:10.1002/mc.21944。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 30Friedl P，Wolf K。《试管旅行：蛋白酶在个体和集体癌细胞侵袭中的作用》。癌症研究。2008;68(18):7247–7249. doi:10.1158/0008-5472.CAN-08-0784。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 31Sabeh F、Ota I、Holmbeck K、Birkedal-Hansen H、Soloway P、Balbin M、Lopez-Otin C、Shapiro S、Inada M、Krane S、Allen E、Chung D、Weiss SJ。通过细胞外基质的肿瘤细胞流量由膜锚定胶原酶MT1-MMP控制。细胞生物学杂志。2004;167(4):769–781. doi:10.1083/jcb.200408028。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 32Pang L，Li Q，Li S，He J，Cao W，Lan J，Sun B，Zou H，Wang C，Liu R，Wei C，Wei Y，Qi Y，Hu J，Liang W，Zhang WJ，Wan M，Li F.膜型1-基质金属蛋白酶诱导食管鳞状细胞癌上皮-间质转化：临床和体外分析观察。科学代表。2016;6(1):22179. doi:10.1038/srep22179。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 33Akanuma N、Hoshino I、Akutsu Y、Murakami K、Isozaki Y、Maruyama T、Yusup G、Qin W、Toyozumi T、Takahashi M、Suito H、Hu X、Sekino N、Matsubara H。MicroRNA-133a调节食道癌中两种侵袭相关蛋白FSCN1和MMP14的mRNA。英国癌症杂志。2014年；110(1):189–198. doi:10.1038/bjc.2013.676。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 34Kwiatkowska A、Kijewska M、Lipko M、Hibner U、Kaminska B。Akt和FAK磷酸化的下调通过损害MT1-MMP穿梭到跛足的能力和下调MMPs的表达来减少胶质母细胞瘤细胞的侵袭。生物化学生物物理学报。2011;1813(5):655–667. doi:10.1016/j.bbamcr.2011.01.020。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 35Groblewska M、Siewko M、Mroczko B、Szmitkowski M。基质金属蛋白酶（MMPs）及其抑制剂（TIMPs）在食管癌发展中的作用。叶组织化学细胞生物学。2012;50(1):12–19. doi:10.5603/FHC.2012.002。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 36Pahwa S、Stawikowski MJ、Fields GB。监测和抑制肿瘤发生和发展过程中的MT1-MMP。癌症。2014年；6(1):416–435. doi:10.3390/cancers6010416。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 37皮卡M、诺维茨基S、摩西HL。TGF-β在肿瘤微环境中的作用。Nat Rev癌症。2013;13(11):788–799. doi:10.1038/nrc3603。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 38Wakefield LM，Hill CS公司。超越TGFbeta：其他TGFbeta超家族成员在癌症中的作用。Nat Rev癌症。2013;13(5):328–341. doi:10.1038/nrc3500。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 39Massague J.TGFbeta在上下文中发出信号。Nat Rev Mol细胞生物学。2012;13(10):616–630. doi:10.1038/nrm3344。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 40Watanabe Y、Itoh S、Goto T、Ohnishi E、Inamitsu M、Itoh-F、Satoh K、Wiercinska E、Yang W、Shi L、Tanaka A、Nakano N、Mommaas AM、Shibuya H、ten Dijke P、Kato M.TMEPAI，一种跨膜TGF-β诱导蛋白，从积极参与TGF-α信号传导中隔离Smad蛋白。分子细胞。2010;37(1):123–134. doi:10.1016/j.molcel.2009.10.028。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 41Crawford SE、Stellmach V、Murphy-Ullrich JE、Ribeiro SM、Lawler J、Hynes RO、Boivin GP、Bouck N.Thrombospondin-1是体内TGF-beta1的主要激活剂。单元格。1998;93(7):1159–1170. doi:10.1016/S0092-8674（00）81460-9。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 42Breitkopf K、Sawitza I、Westhoff JH、Wickert L、Dooley S、Gressner AM。凝血酶原反应蛋白1通过肝星状细胞中的两种不同机制，充当转化生长因子β效应的强促进剂。内脏。2005;54(5):673–681. doi:10.1136/gut.2004.042911。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 43Massague J、Seoane J、Wotton D.Smad转录因子。基因发育。2005;19(23):2783–2810. doi:10.1101/gad.1350705。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 44Itoh S，ten Dijke P.TGF-β受体/Smad信号转导的负调控。当前操作细胞生物学。2007;19(2):176–184. doi:10.1016/j.ceb.2007.02.015。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 
