TALEN或CRISPR敲除vs.shRNA或siRNA敲除

Ed Davis博士。

基因组编辑技术的最新进展——利用TALEN或CRISPR对基因进行有针对性的永久性改变——彻底改变了分子遗传学。他们还为用户提供了在这些相对较新的技术和使用短发夹RNA（shRNA）或短干扰RNA（siRNA）的更成熟的RNA干扰（RNAi）介导的敲除方法之间的选择。在本技术说明中，我们探讨了两种消融基因功能的方法之间的差异，以及一种技术比另一种更合适的情况。

RNAi介导的基因沉默

在高等真核生物中，RNAi介导的敲除是耗尽细胞中感兴趣的基因产物的最常见策略。然而，RNAi通常不会完全关闭该基因。本质上，短（约20-25个核苷酸）双链RNA分子要么由发夹形成前体（shRNAs）生成，要么由外源性（siRNAs。经Dicer处理后，单链RNA碱基与靶mRNA结合（Ketting，2013）。根据生物体的不同，RNA干扰介导的基因沉默由精氨酸蛋白通过mRNA降解或翻译抑制进行（图1）。最终结果是基因表达的转录后下调，而不改变遗传密码（Mittal，2004）。一些功能性RNA或蛋白质仍然存在，并在较低水平上被翻译。因此，减少基因功能的RNAi策略被称为“击倒”。基因功能降低，但并未消除。

 

图1。RNAi途径的总体方案。摘自Mittal（2004）。

 

基因敲除的基因组编辑

相比之下，基因组编辑改变了遗传密码，通常会导致“基因敲除”或基因功能的完全消除。这一过程始于染色体上产生双链断裂（DSB）（Bogdanove&Voytas，2011）。最近，开发了两种高效生成DSB的工具：转录激活物样效应器核酸酶（TALENs）和簇状、规则间隔回文重复相关（CRISPR-Cas）蛋白（Bogdanove&Voytas，2011；Jinek等，2012；Shalem等，2014；Wang等，2014）。这两种工具均适用于导致植物致病（TALEN）或保护基因组免受插入突变（CRISPR-Cas）的细菌系统。TALEN是由融合到限制性内切酶FokI的位点特异性DNA结合蛋白组成的嵌合蛋白。CRISPR-Cas使用一个位点特异性的20核苷酸单引导RNA（sgRNA）将Cas9核酸酶带到其目标位点。对于TALEN和CRISPR-Cas，核酸酶切割靶的两条DNA链。这种断裂必须修复，否则细胞就会死亡，所以真核细胞的反应主要有两种机制（图2）。第一种是非同源末端连接（NHEJ），重新连接两个自由染色体末端。然而，NHEJ容易出错，通常会导致小的插入或缺失，从而破坏或敲除基因。或者，细胞可以通过同源重组（HR）修复DSB，这为研究人员提供了更多的基因敲除选项。可以引入定义的缺失，可以创建插入突变，或者改变单个碱基，等等。

图2。基因组编辑工具诱导的DSB修复途径。左图：非多孔端接。右：供体模板存在下的同源重组。

RNAi与基因组编辑的比较

那么，哪种策略更好：RNAi介导的敲除，还是基因组编辑介导的基因敲除？这取决于实验目标（表1）。事实上，有些人混淆了这两种策略，将基因组编辑称为“击倒”。这种混淆可能是由于这样一个事实，即在基因组编辑变得可行之前的许多年里，在高等真核生物中消除基因功能的最实用策略是使用RNAi。因此，研究人员已经习惯了“击倒”一词。

 

方法	敲门 向下	敲门 外面的	遗传的 代码	更改 表达 水平	克隆 隔离，隔离 必修的
RNA干扰 （shRNA、siRNA）	√			√
基因组编辑 （TALEN、CRISPR）		√	√	√	√

表1。基因消融中RNA干扰和基因组编辑方法的比较。

基本上，当改变遗传密码是不可取的时，RNAi介导的敲除比基因组编辑更可取。例如，你可能想暂时降低基因功能，这样你就可以暂时将siRNA转染到细胞中。在几代人的时间里，siRNAs丢失，恢复了正常的基因功能。或者，你可以将shRNAs稳定地整合到基因组中，并从可诱导的启动子表达它们。然后你可以降低基因的表达，然后在所需的时间和/或在特定组织中反复恢复。此外，与基因组编辑介导的基因敲除不同，shRNA-介导的敲除不需要分离单个克隆，因此涉及的工作较少。最后，完全消除基因功能可能会损害细胞，但部分损失不会。

或者，为了获得真正的基因空等位基因，基因组编辑更可取（Wang等人，2013）。此外，可能需要引入一个特定的点突变，或将预先存在的突变纠正回野生型。最后，你可能想给你喜欢的基因添加一个融合标签，并从其内源性位点表达它。这些目标完全取决于基因组编辑方法。

GeneCopoeia为RNA干扰和基因组编辑提供先进的全方位服务解决方案，从shRNAs和TALEN或CRISPR质粒的设计和构建，一直到稳定细胞系和转基因小鼠的产生。请访问我们的网站了解更多信息：www.genecopoeia.com。

工具书类

Bogdanove&Voytas（2011年）。TAL效应器：可定制的DNA靶向蛋白质。科学类333, 1843.

Jinek等人（2012年）。一种可编程的双RNA引导的DNA内切酶，用于适应性细菌免疫。科学类337, 816.

Ketting（2011）。RNAi的许多方面。开发单元20, 148.

米塔尔（2004）。提高哺乳动物RNA干扰的效率。Nat.Rev.基因。5, 355.

Shalem等人（2014年）。在人类细胞中进行基因组级CRISPR-Cas9敲除筛查。科学类343, 84.

Wang等人（2013）。TALEN介导的小鼠Y染色体编辑。自然生物技术。31, 530.

Wang等人（2014）。使用CRISPR-Cas9系统对人类细胞进行基因筛查。科学类343, 80.

 

版权所有©2014 GeneCopoeia，Inc。 电子邮件：查询@genecopoipe.com 电话：+1（866）360-9531 TNGE1-021814公司