IndelCheck™：强大的CRISPR/TALEN验证和筛选工具
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Ed Davis博士。 |
介绍
基因组编辑CRISPR公司或人才通常需要大量的筛选工作来识别正确修改的细胞克隆或动物，因此需要有效的验证和筛选工具来配合这些试剂。也许最广泛使用的验证和筛选工具是“错配切割试验”。GeneCopoeia的IndelCheck™插入和删除检测系统简化错配切割分析，以帮助客户进行基因组编辑。在本技术说明中，我们讨论了执行验证分析的好处，并展示了indelCheck™系统如何成为基因组编辑应用程序验证和筛选的最佳选择。
为什么CRISPR和TALEN功能验证很重要？
我们建议您在执行完整的基因组编辑项目之前验证CRISPR sgRNAs或TALEN的效率。尽管CRISPR和TALEN为基因组编辑提供了高效的方法，但由于单个目标位点的性质，单个编辑工具本身的效率差异很大。因此，在进行大量筛选工作之前，确定哪些CRISPR或TALEN克隆具有成功编辑基因组的最大潜力是非常有益的。
我们建议采用错配切割试验（也称为Surveyor™试验）进行功能验证。indelCheck™错配切割试验是一种基于细胞培养的试验，旨在有效检测由双链断裂（DSB）介导的非同源末端连接（NHEJ）产生的indels。图1说明了用于CRISPR或TALEN功能验证的indelCheck™错配裂解分析的基本工作流程。
图1。indelCheck™错配切割分析的工作流程。对暴露于CRISPR或TALEN的细胞群体，使用靶位点两侧的引物进行基因组DNA PCR。PCR产物的变性和再退火产生了同双链和异双链分子的混合群体。用T7内切酶I处理片段，该酶仅切割异双链分子。用标准琼脂糖凝胶电泳检测裂解产物。
使用IndelCheck™错配切割试验进行CRISPR或TALEN功能验证
如果您正在培养的哺乳动物细胞中进行基因组编辑，我们建议使用您正在使用的相同细胞系进行验证。如果你正在工作体内例如，在小鼠或大鼠中，然后在模型细胞系中执行验证分析，例如小鼠的Neuro2A或NIH3T3，或大鼠的PC-12。
如图1所示，CRISPR Cas9/sgRNA或TALEN克隆用于瞬时转染细胞系。即使基因组编辑实验需要供体，供体质粒也不包括在这些验证转染中。indelCheck™错配切割试验仅检测NHEJ介导的事件，无论是否存在供体。
接下来，在转染后一到两天，将细胞作为池收集，并使用围绕DSB位点的引物进行PCR。典型的PCR设计策略如图2所示。
图2。indelCheck™错配切割分析的PCR引物设计策略。使用黄色突出显示的引物序列生成PCR产物。GeneCopoeia建议扩增子大小在500-1000个碱基对范围内。此外，PCR引物序列的选择应确保DSB位点与中间至少偏移100 bp。上述扩增子是人类HDAC6基因（NCBI GeneID:9636）的989 bp区域。该序列包含3个正在测试的CRISPR sgRNA靶位点（以绿色、青色和品红色突出显示）。预计成功的错配切割产物为341 bp+648 bp（绿色）、555 bp+434 bp（洋红色）和616 bp+373 bp（青色）。
下一步是对细胞群进行PCR。NHEJ指数的形成是一个随机过程；索引的类型（插入或删除）和长度因编辑个体而异，如图3所示。因此，如果CRISPR或TALEN-mediated indel形成成功，细胞池将由混合群体组成，每个细胞在靶位点携带不同的等位基因。混合物可能非常复杂，由未修饰的等位基因和不同的突变等位基因组成。
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图3。NHEJ介导的吲哚导致的等位基因分布示例。顶部：人类中的野生型（未修改）CRISPR目标序列电磁X1基因，然后是四个不同的缺失等位基因（D）和一个插入等位基因，在编辑的克隆中发现。摘自Cong等人（2013）。 |
PCR产物通过加热至95变性0C、 然后缓慢冷却至室温，使其恢复自然状态。冷却步骤导致匹配和不匹配的链彼此退火，从而分别形成同源双链和异源双链DNA（图1）。
最后，再退火的DNA用T7内切酶I消化，这是一种裂解异双链而非同双链DNA的酶。裂解产物在标准琼脂糖凝胶上电泳。通常，如果发生NHEJ，将观察到三条带：一条带对应于未消化（同源双链）DNA，而其他两条带是异源双链DNA的裂解产物（图4）。
| 图4。错配切割产物的琼脂糖凝胶电泳。在用表达图3中sgRNAs的CRISPR克隆转染HEK293细胞后，进行indelCheck错配切割试验。用T7内切酶I（T7EI）消化（-）和（+）后的退火产物在2%琼脂糖凝胶上分离。用星号标记的条带出现在T7核酸内切酶I处理的通道中，其大小与CRISPR预测的成功修饰的大小相同，表明为实验设计的每个sgRNAs都是功能性的。加扰控制通常是 预计不会产生任何解理 |
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| 乐队。然而，在本例中，在T7 EI消化后出现解理带。这可能是由于不同染色体之间存在自然发生的多态性。在本实施例中，加扰对照泳道中的切割带与sgRNAs 1、2和3观察到的切割带大小不同，因此不会导致假阳性结果。 |
使用indelCheck™错配卵裂分析筛选编辑个体
IndelCheck™系统还可用于筛选NHEJ介导的淘汰赛。筛选程序与验证程序相同。然而，单个细胞克隆可能不包含不同等位基因的混合群体。相反，如果克隆是同一个indel突变的纯合子，则在IndelCheck™分析过程中不会形成异源双链DNA，因此这样的克隆不会被检测为已被修改。为了防止这种情况发生，我们建议在T7核酸内切酶I治疗之前，用来自阴性、未修饰对照的PCR DNA加标PCR产物DNA。这一步骤将在所有修饰的克隆中耐受异源双链DNA的存在。一旦识别出编辑过的克隆，PCR产物应进行TA亚克隆和测序，以确认是否存在修饰以及等位基因的结构。
indelCheck™插入或删除检测系统
indelCheck™系统由可以一起订购或单独订购的组件组成（表1）。您可以购买完整的系统（目录号IC001和IC002），该系统包括执行PCR和T7核酸内切酶I裂解所需的所有系统。靶位点特异性PCR引物单独出售。或者，可以单独购买靶位PCR（目录号IC003和IC004）和T7核酸内切酶I试剂盒（目录号IC 005和IC006）。
表1.indelCheck™插入或删除检测系统的订购选项。*目标位点PCR引物不包括在内，但可在我们的网站上购买。
在GeneCopoeia，我们的基因组编辑团队在哺乳动物系统中拥有丰富的CRISPR和TALEN试剂专业知识。我们从TALEN和CRISPR设计开始，并交付经序列验证的质粒DNA。我们还为您的TALEN和CRISPR构建物提供功能验证服务，构建含有TALEN或CRISPR-介导的感兴趣修饰的稳定细胞系或转基因小鼠，并提供科学咨询服务以帮助您规划项目。有关更多信息，请访问我们的网站：https://www.genecopoeia.com，致电1-301-762-0888，或发送电子邮件inquiry@genecopoeia.com
工具书类
聪，等. (2013). 使用CRISPR/Cas系统的多重基因组工程。科学类 339, 819
邱，等. (2004). 使用Surveyor™核酸酶进行突变检测。生物技术 36, 702.
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