基因组编辑：基因Copoeia CRISPR sgRNA库的应用
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Ed Davis博士。 |
生物医学研究人员正在享受功能基因组学的复兴，其目的是利用丰富的DNA序列信息，尤其是人类基因组的完整序列，来确定基因组编码基因的自然作用。因此，生物化学网络和途径将得到更好的理解，以期改进疾病治疗。
功能基因组学的一个主要方法是通过“击倒”（减少）或“敲除”（完全消除）来清除基因功能。自2012年以来，研究人员越来越多地转向CRISPR（集群式、规则间隔、短回文重复序列）进行功能基因组学研究。CRISPR的简单RNA-引导机制为许多应用提供了一种快速、方便和相对低成本的方法，包括基因敲除、框架内融合标记、突变和转基因敲除。一些研究小组最近通过开发大规模的CRISPR sgRNA文库，将CRISRP应用于高通量敲除应用。GeneCopoeia最近推出了一些较小的、以通路和基因组为中心的CRISPR sgRNA文库，与全基因组文库相比，它们具有一些关键优势。在本技术说明中，我们讨论了CRISPR sgRNA文库的优点和应用，如何使用CRISPRs sgRNA库，使用小型、以通路和基因群为中心的文库的优势，以及GeneCopoeia如何帮助您进行高通量CRISRP敲除研究。
图1。基因组编辑工具诱导的DSB修复途径。左：NHEJ。右图：HR在供体构建物面前。
什么是CRISPR sgRNA库？
CRISPR sgRNA文库是数百到数千个质粒的集合，每个质粒表达一个独特的染色体靶向单导向RNA（sgRNA）化脓性链球菌Cas9导致染色体中的双链断裂（DSB）（图1）。DSB要么通过同源供体构建中的同源重组（HR）修复，要么通过非同源末端连接（NHEJ）修复导致敲除突变。
CRISPR sgRNA文库使研究人员能够同时敲除哺乳动物细胞中的许多基因，为许多应用打开了大门，例如药物靶点识别、药物靶点验证、表型变化和报告分析。以前，这些应用是通过RNA干扰（RNAi）实现的。例如，Sethi等人（2012年）使用针对6000个“可用药”基因的shRNA库来识别卵巢癌细胞中的潜在靶点。Cooper和Brockdorff（2013）使用shRNA库来识别激活Gata6-neo启动子报告子的因子。最后，Zhang等人（2014）使用荧光激活细胞分选（FACS）分离出表达细胞表面标记物PSA-NCAM的细胞，该标记物在人类胚胎干细胞（hESCs）中表达。
虽然shRNA文库可用于高通量功能丧失筛选，但与CRISPR相比，RNAi有许多缺点：1）RNAi会导致基因表达水平下降。因此，可以忽略由残余基因表达导致的假阴性；2） RNAi只作用于细胞质RNA，因此不能像长的非编码RNA那样沉默核RNA。相反，CRISPR会永久改变遗传密码。因此，CRISPR可以完全敲除基因的所有等位基因，无论其转录产物定位于细胞核还是细胞质。
如何使用CRISPR sgRNA库？
使用sgRNA文库很简单。然而，为了使文库有用，有一个“读数”（可观察的表型或分析）是很重要的（图2）。简单地说，sgRNA文库通常用作慢病毒颗粒库，尽管质粒也可以将细胞转染为DNA。我们的文库克隆包含sgRNA靶位点，但不包含Cas9，这是必需的。因此，你需要用sgRNAs和Cas9共同转染/转染你的细胞，或者转染/转化已经稳定表达Cas9的细胞系。对于慢病毒转导，我们建议首先建立稳定表达Cas9的细胞系；Cas9的大尺寸限制了病毒的滴度，因此仅用sgRNA-表达的慢病毒进行转导更有效。无论如何，细胞被DNA转染或感染慢病毒池，然后筛选感兴趣的反应。一些筛选读数的示例包括：
- 细胞死亡。携带致命敲除物的细胞在存活细胞池中的代表性不足。
- 耐药性：对感兴趣药物产生耐药性的细胞在药物治疗后会在池中过度出现。
- 报告者分析：FACS后，失去表达荧光报告者（如GFP）能力的细胞在人群中的代表性不足。
在应用读出方法或分析后，DNA测序用于确定哪些sgRNAs在池中表现不足或过度。对于一个非常大的全基因组文库，有必要使用下一代测序来识别这些靶向候选基因的sgRNAs。
CRISPR sgRNA文库的开发
鉴于CRISPR相对于RNAi在消除基因功能方面的优势，一些研究人员已经制作了大型CRISPR-sgRNA文库。在一项研究中，Wang等人（2014）构建了靶向7300个基因的sgRNA-表达慢病毒颗粒库，用于感染稳定表达Cas9核酸酶的单倍体细胞系。在筛选抗6-硫鸟嘌呤核苷的转基因细胞系时，这些研究人员观察到，在错配修复途径中携带sgRNAs靶向基因的细胞富集，但在其他DNA修复途径中没有富集。同样，张峰（Feng Zhang）在麻省理工学院的团队使用了一个针对约18000个基因的慢病毒sgRNA库来识别对vemurafenib敏感或耐药的黑色素瘤和干细胞（Shalem等人，2014）。自那以后，张实验室通过生产第二代文库对最初的研究进行了跟进，该文库包含了一些改进，并以人类和小鼠中的大量基因为目标。（Sanjana等人，2014）。
图2。使用CRISPR sgRNA库的基本工作流程。A.共用屏幕。细胞感染每个sgRNA文库池。对感染池进行筛选，以获得所需的读数或表型。对汇集的细胞进行Sanger测序以检测单个sgRNAs，或进行深度测序以寻找单个sgRNA的过度或不足表达。B.GeneCopoeia GeneHero™CRISPR sgRNA文库可作为库或单个sgRNA使用。如果需要，细胞可以感染表达单个sgRNAs的慢病毒。对板或孔进行筛选，以获得读数或感兴趣的表型。与感兴趣表型相对应的单个sgRNAs已经已知，但没有测序。
GeneCopoeia GeneHero™CRISPR sgRNA文库
最近，《基因药典》推出了一系列预制的CRISPR sgRNA文库，这些文库针对较小的基因组和途径（表1）。
表1。GeneCopoeia GeneHero™预先制作的人类CRISPR sgRNA文库。每个文库都可以从我们的网站订购成细菌库、转染成熟DNA或慢病毒颗粒库。
每个sgRNA都是单独构建、序列验证和培养的大肠杆菌与其他CRISPR sgRNA文库相反，前者从一开始就是作为库构建的。与其他sgRNA文库相比，GeneCopoeia的CRISPR sgRNA库具有一些特殊优势，例如：
- 每个sgRNA的单独构建使得可以购买库作为池或单个克隆。
- 序列验证提供了每个sgRNA的高质量。
- 每个sgRNA的单独构建和培养确保了在池中的最佳表现。
- 较小的库大小减少了分析结果所需的工作量和时间。您可以使用桑格或下一代测序来筛选候选基因库。
我们的sgRNAs文库被克隆到一个非常通用的载体主干中（图3），可以用于直接转染细胞、包装成慢病毒颗粒或在体外转录。
| 图3。GeneCopoeia GeneHero™CRISPR sgRNA文库中携带单个sgRNA的质粒主干。 |
GeneCopoeia GeneHero™CRISPR sgRNA文库的另一个显著优势是，由于sgRNA克隆是在汇集之前单独构建的，研究人员可以订购自定义文库，在其中我们可以“混合和匹配”来自不同文库的sgRNA复制。此外，我们还可以创建针对新基因集的自定义CRISPR sgRNA库。
相关产品和服务
除了我们多功能、高质量的CRISPR sgRNA库外，我们还提供一些配套产品和服务（表2）。这些包括从人类AAVS1 Safe Harbor基因座稳定表达Cas9核酸酶的预先制备的细胞系，以及供者克隆，您可以使用我们的人AAVS1安全港敲除试剂盒将Cas9敲入您选择的细胞系中的AAVS1。我们还提供稳定的细胞系服务，在这种服务中，我们可以构建一种细胞系，携带几乎任何感兴趣的修饰，包括在选定的细胞系中表达来自AAVS1的Cas9。
结论
在本技术说明中，我们重点介绍了基因组编辑领域不断发展的一项新的令人兴奋的技术发展：CRISPR sgRNA文库。作为全基因组文库的替代品，GeneCopoire提供了几个强大、高质量和通用的CRISPR sgRNA文库，靶向较小、集中的途径和基因组。要了解更多有关GeneCopoeia GeneHero™CRISPR sgRNA库如何加速您的研究的信息，请访问我们的网站：https://www.genecopoeia.com，或致电301-762-0888。
定制稳定细胞系服务可根据要求提供。联系我们获取报价。
表2。GeneCopoeia GeneHero™CRISPR sgRNA库的配套产品和服务。
工具书类
Cooper和Brockdorff（2013）。全基因组shRNA筛选，以确定介导小鼠胚胎干细胞Gata6抑制的因子。开发 140, 4110.
塞提，等., (2012). 人类可药物基因组的RNA干扰致死性筛查，以确定上皮性卵巢癌的分子易损性。普洛桑 7.
沙勒姆，等. (2014). 在人类细胞中进行基因组级CRISPR-Cas9敲除筛查。科学类 343, 84.
Sanjana等人（2014）。用于CRISPR筛查的改良载体和全基因组文库。自然方法 11, 783.
王，等. (2014). 使用CRISPR-Cas9系统对人类细胞进行基因筛查。科学类 343，80。
Zhang等人（2014）。人类干细胞分化的功能基因组筛查揭示了参与神经发育和神经变性的途径。美国国家科学院程序 110, 12361.
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