介绍All-in-One™qPCR与经验证的引物混合,提供通用的qPCR反应条件和可靠的定量PCR数据。联合开发和共同优化的All-in-One qPCR混合物和基因特异性引物提供了您所需要的全部优势,而没有您期望的任何高成本:
- 统一的反应条件减少了实验设计时间,从而可以提前提交期刊
- 即使对于低拷贝基因,高扩增效率和灵敏度也意味着每次定量都可靠
- 无非特异性扩增*和无引物二聚体*可确保数据的重现性和可发布性
All-in-One qPCR混合使用高保真热启动聚合酶、优化的反应缓冲液和高质量的dNTP,以实现甚至低拷贝RNA(cDNA)或DNA物种的特异性和敏感性扩增(图1)。
图1。使用全合一qPCR主混合物进行qPCR反应。使用GeneCopoeia All-in-One cDNA合成试剂盒反向转录来自MCF-7细胞的1微克总RNA。RT反应稀释至1pg至1ng RNA/µl。使用GeneCopoeia All-in-One qPCR Mix(A)在随后的qPCR中使用1µl稀释RT反应进行35个周期。最终产品在2%琼脂糖凝胶(B)上运行。
图2。2X All-in-One™qPCR Mix的扩增效率和检测灵敏度通过5×10质粒DNA梯度稀释制成的标准曲线进行评估6到5个分子。扩增和熔化曲线的峰值表明,使用All-in-One™qPCR Mix可以获得很高的灵敏度,它可以检测低至5个分子。同时,各浓度之间的良好线性关系也显示出较高的放大效率。全合一qPCR验证引物完成工作
从《基因药典》中消除了无休止的精确qPCR调整和优化。只需添加All-in-One引物并开始。All-in-One qPCR人鼠或鼠特异性引物由专利算法设计并验证†精确性能。引物验证包括熔化曲线,以确保扩增正确的目标DNA(图2)。
与All-in-One SYBR结合使用时®Green qPCR Mix,All-in-One引物在定量PCR分析中提供可靠且可重复的高性能。
图3。实验验证了45对基因特异性All-in-One™qPCR引物,以产生单个解离曲线峰,并为目标基因生成正确大小的单次扩增。cDNA池包含来自10种不同人类组织(肺、肝、睾丸、卵巢、脾、脑、胎盘、胰腺、心脏和乳腺)的总RNA的逆转录产物,用作qPCR验证模板。qPCR使用0.2µM引物和2X All-in-One qPCR Mix进行。反应在95℃下培养10分钟,然后在95℃条件下40次循环10秒。;使用Bio-Read iQ5仪器,60°C,20秒和72°C,15秒。在最后一个循环结束时,温度从72°C升高到95°C,以产生熔化曲线。10个样品的扩增曲线、熔化曲线和琼脂糖凝胶电泳(奇数道阳性和偶数道无模板对照(NTC)的验证结果)。
*当全合一验证的PCR引物和PCR混合物一起使用时,可确保非特异性扩增和缺乏引物二聚体。†针对人类、小鼠和大鼠自动验证引物。询问其他物种的验证。
常见问题解答
常见问题:qPCR阵列和试剂
答案:有了这些阵列,你就不需要花时间设计引物和验证基因和miRNAs。这些阵列允许您在同一个96孔或384孔板中同时对基因或miRNA进行批量qPCR检测。这大大简化和加速了你的实验。
答案:家政基因通常被用作参考基因,但它们的表达并不固定。特定管家基因的表达变化取决于实验条件。最好的方法是选择一系列常见的家政基因,分析它们在不同条件下的表达水平,然后选择一个稳定表达的基因。
答案:您选择使用哪种RT引物在很大程度上取决于实验设计。如果你使用随机引物,逆转录将在RNA中的许多不同位置开始。如果你使用寡核苷酸(dT),逆转录会在poly-A尾部开始。在特定基因的定量RT-PCR检测中,我们建议在一个反应中同时使用随机引物和寡核苷酸(dT),以获得更高的反转录效率。此外,您可以使用自己的序列特异性引物在一步RT-PCR反应中启动逆转录。
答案:这些产品中使用的DNA聚合酶是一种特殊的化学修饰热启动酶。在95℃下培养10分钟可激活酶。
答案:该试剂盒仅检测成熟miRNA的表达。
答案:miRNA qPCR扩增产物约为75bp。产品的熔化温度一般在75℃至83℃之间。
答案:大多数GeneCopoeia All-in-One™miRNA引物设计用于识别模板序列的3'末端。matrue miRNA和pre-miRNA在碱基序列的3'端具有不同的序列。因此,GeneCopoeia All-in-One™miRNA引物不会扩增前miRNA。
答案:实验过程包括两个主要步骤(图1)。在第一步中,使用polyA聚合酶将polyA尾部添加到miRNA的3'端。同时,MMLV逆转录酶使用独特的寡核苷酸(dT)适配器引物,从polyA末端逆转录miRNA。第二步,使用miRNA-specific正向引物和Universal Adaptor引物作为PCR引物对,以及包含SYBR®Green的qPCR主混合,专门检测反向转录的miRNA。
图1。GeneCopoeia All-in-One™miRNA qRT-PCR检测试剂盒使用的实验设计
答案:cDNA池包含10个人类组织总RNA样本的逆转录产物,用作验证模板。使用0.2 uM引物和GeneCopoeia All-in-One™qPCR Mix进行qPCR。经验证,GeneCopoeia All-in-One™qPCR引物(或GeneCocoeia All-in-One™miRNA qPCR引子)可为靶基因和miRNA生成正确大小的单个扩增子,并产生单个解离曲线峰值。
答案:与GeneCopoeia All-In-One™miRNA引物结合使用,GeneCocoeia All-In-One™micRNA qRT-PCR检测试剂盒可以从10 pg小RNA或20 pg总RNA中检测miRNA。
答案:PolyA聚合酶将poly-A尾部添加到所有miRNAs的3'端,可以在同一试管中逆转录到第一链cDNA。所得产物可用于通过qPCR检测任何所需miRNA的表达。相比之下,干环被设计成只检测一个或几个特定的miRNAs,其3'末端碱基与其粘性末端配对。因此,要检测这种miRNA,你必须选择一个匹配的茎环。可能需要同时进行多个RT反应。
答案:总RNA比小RNA具有更多类型的RNA,因此在qRT-PCR检测分析中提供了更多的模板来扩增。这有助于提高扩增敏感性,但也可能降低扩增特异性。
答案:“RT”井在逆转录控制中含有一个刺突,可用于监测逆转录反应的效率。RT孔中预先加载的引物对专门放大从样本中外源RNA尖峰逆转录的对照cDNA模板。“PCR”井是一个阳性PCR对照,用于通过使用特定的预载引物对扩增预载DNA模板来验证PCR效率。如果RNA样品质量高,循环程序已正确运行,阈值已正确定义,“RT”井的Ct值应为20±3,“PCR”井的所有阵列或样品的Ct应为20。
答案:每个GeneCopoeia ExProfile™基因qPCR阵列中的“GDC”孔是基因组DNA控制。这用于检测每次qPCR反应期间每个样本中是否存在任何基因组DNA污染。基因组DNA控制的Ct值低于35表示存在可检测到的基因组DNA污染。确保从RNA样本中去除尽可能多的基因组DNA和残留污染物。