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.1999年1月1日；13(1):76-86.
doi:10.1101/gad.13.1.76。

Keap1通过与氨基末端Neh2结构域结合抑制Nrf2对抗氧化反应元件的核激活

伊藤K 1, N Wakabayashi村, Y加藤, T石井, 伊加拉希K, J D恩格尔, 山本M
附属公司

Keap1通过与氨基末端Neh2结构域结合抑制Nrf2对抗氧化反应元件的核激活

伊藤K等。 基因开发. .

摘要

转录因子Nrf2对于抗氧化反应元件（ARE）介导的II期解毒和氧化应激酶基因的诱导至关重要。对转染细胞系中显示的Nrf2差异活性的详细分析最终导致了一种新蛋白的鉴定，我们将其命名为Keap1，该蛋白通过特异性结合其进化上保守的氨基末端调控结构域来抑制Nrf2的转录活性。Keap1最接近的同源物是果蝇肌动蛋白结合蛋白Kelch，这意味着Keap1可能是Nrf2细胞质效应器。然后我们发现，亲电试剂拮抗Keap1对体内Nrf2活性的抑制，使Nrf2从细胞质传到细胞核并增强ARE反应。我们假设Keap1和Nrf2构成氧化应激的关键细胞传感器，共同介导信号通路中的关键步骤，通过这种新的Nrf2核穿梭机制导致转录激活。Nrf2的激活反过来导致II相酶和抗氧化应激基因的诱导，以响应电泳和活性氧物种。

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数字

图1
图1
鸡和人Nrf2蛋白之间保守区域的示意图。(A类)在人类和鸡Nrf2之间发现了六个保守结构域，命名为Neh1–Neh6。Neh1对应于CNC区域和bZip结构。(B类)Neh2的序列同源性。至少两种蛋白质之间保守的氨基酸残基被遮蔽。包括疏水区在内的33个氨基末端残基在Nrf1、hNrf2和cNrf2（ECH）之间是保守的；Neh2接下来的40个残基富含亲水残基，并且在跨物种Nrf2分子之间特别保守。含有亲水残基的显著同源区域被装箱。（▾）限制性酶位点。
图2
图2
Gal4 DBD–Nrf2融合蛋白的转录激活活性。(A类)Gal4 DBD–Nrf2融合蛋白的示意图。Gal4–Nrf2#5含有Gal4 DBD和全长鸡肉Nrf2（ECH）。(B类)Nrf2嵌合蛋白的反激活活性。通过对鹌鹑成纤维细胞系QT6的共转染实验，利用一种新的免疫荧光标记技术，测定了每种融合蛋白的反式激活活性LUC公司报告质粒，由五个Gal4结合位点转录导向。每列对应于中所示的构造A类.勒克在没有任何效应质粒的情况下，报告质粒的活性被任意设置为100，三个独立实验的平均值（每个实验重复进行）以平均值的标准误差显示(s.e.公司。).
图3
图3
Neh2结构域是HD3成红细胞中Nrf2活性负调控所必需的。(A类)cNrf2野生型和Neh2缺失突变体（M1）的示意图。(B类,C类)将增量野生型和突变型Nrf2表达质粒分别转染到QT6细胞或HD3成红细胞。（）野生；（○）M1.同时转染pRBGP2报告子，该报告子包含来自鸡β-珠蛋白增强子的三重MARE结合位点。勒克野生型Nrf2的活性在效应物/报告物比率为20时被任意设置为100%B类，并且将效应器/报告者比率为24的突变体的效应器/报道者比率设置为100%C类。三个独立实验的平均值显示为s.e.公司。
图4
图4
Gal4 DBD–Neh2的过度表达可恢复HD3细胞中的Nrf2依赖性激活。将全长cNrf2表达质粒（4μg）与pRBGP2报告子（0.5μg）在编码Gal4 DBD–Neh2或Gal4 DB的表达质粒浓度增加的情况下共同转染到HD3细胞中。LUC公司在没有效应质粒的情况下，活性被任意设置为0.1。三个独立实验的平均值显示为s.e.公司。请注意，添加Gal4 DBD–Neh2可从HD3细胞的抑制中释放Nrf2活性。（缝合钢筋）Gal 4–Neh2；（阴影条）Gal4–DBD。
图5
图5
Keap1的双杂交筛选。(A类)Keap1的结构同源性果蝇属Kelch蛋白，包含BTB和DGR结构域。方框G表示DGR域。(B类)Keap1与人类克隆KIAA0132具有高度相似性（Nagase等人，1995年）。这两种蛋白质之间保守的氨基酸身份被遮蔽了。
图5
图5
Keap1的双杂交筛选。(A类)Keap1的结构同源性果蝇属Kelch蛋白，包含BTB和DGR结构域。方框G表示DGR域。(B类)Keap1与人类克隆KIAA0132具有高度相似性（Nagase等人，1995年）。这两种蛋白质之间保守的氨基酸身份被遮蔽了。
图6
图6
Nrf2的Neh2域和Keap1的DGR域之间的相互作用。(A类)野生型和突变型Gal4 DBD–Neh2融合蛋白（B1至B4）和Gal4 AD–Keap1融合蛋白（L1–L3）的示意图。结构B1包含全长Neh2。B4与图3中Nrf2的Neh2缺失突变体的结构相同。B2在Neh2中包含两个氨基酸取代，而B3缺少氨基末端15残基。L2和L3分别缺乏Keap1的DGR或BTB域。(B类)将各种Gal4-DBD和Gal4-AD融合蛋白的表达质粒以给定的组合导入报告酵母菌株。对产生的转化子进行了His测试+通过发现His的表型负极或他的+盘子。(C类)BIAcore相互作用分析的结果。在三种不同浓度下测试配体（GST–Neh2，氨基酸1–73，阴影条）或单独的GST（开放条）和分析物（MBP–Keap1–DGR，氨基酸308–624）的结合。试验和控制值一式三份，用s.e.公司。
图7
图7
Keap1抑制Nrf2活性。(A类)将数量不断增加的Keap1表达质粒与数量恒定的pRBGP2报告子和野生型或Neh2缺失突变体（M1）cNrf2表达质粒共同转染到（通常为Nrf2容许）QT6细胞中。(B类)随着野生型mNrf2或第二个cNrf2突变体（仅缺少保守的亲水核心；氨基酸33-73）表达质粒和pRBGP2报告基因的恒定浓度，Keap1表达质粒数量的增加被转染到QT6细胞。在没有任何效应质粒的情况下，LUC活性被任意设置为100，三个独立实验的平均值，每个实验重复进行，用s.e.公司。
图8
图8
亲电试剂将Nrf2从Keap1的阻遏中解放出来。将Nrf2和Keap1表达质粒转染到QT6成纤维细胞中。培养12小时后，用新鲜培养基清洗细胞，然后增加DEM的量(A类)或邻苯二酚(D类)添加到替换培养基中。QT6细胞再培养36小时。LUC公司仅转染pRBGP2报告基因的细胞的报告活性(B类)或报告者和Nrf2表达质粒(C类)和使用DEM处理的，也显示为控件。三个独立实验的结果显示为s.e.公司。
图9
图9
Keap1和Neh2的亚细胞定位。(A、 B类)Keap1–GFP的亚细胞定位。GFP单独表达质粒(A类)或Keap1–GFP融合蛋白(B类)转染QT6细胞。(C、 D类)Neh2–GFP的亚细胞定位。将Neh2（mNrf2）–GFP融合蛋白的表达质粒单独转染293T细胞(C类)或与表达Keap1的质粒结合(D类).
图10
图10
Nrf2的亚细胞定位。仅Nrf2(A、 B类)或Nrf2和Keap1(C、 D类)在293T细胞中表达力。Nrf2和Keap1在100μ米数字高程模型(E、 F类). (A、 C、E)使用抗人Nrf2抗体检测Nrf2的定位；(B、 D、F)同样的区域用碘化丙啶染色。箭头和箭头C类和D类分别显示了文中描述的特征性核周环结构。
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