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.1998年9月15日；12(18):2842-51.
doi:10.1101/gad.12.18.2842。

人SWI/SNF染色质重塑复合物的有丝分裂失活

S Sif公司 1, P T Stukenberg公司, M W Kirschner先生, R E金斯顿
附属公司

人SWI/SNF染色质重塑复合物的有丝分裂失活

S Sif公司等。 基因开发. .

摘要

在有丝分裂过程中，染色质浓缩成有丝分裂染色体，转录受到抑制，这一过程可能与SWI/SNF复合物的染色质重塑活动相反。Brg1和hBrm是人类SWI/SNF（hSWI/SNF）复合物的组成部分，最近发现在有丝分裂期间被磷酸化。这表明磷酸化可能被用作调节SWI/SNF活性的开关。使用表位标记策略，我们在细胞周期的不同阶段纯化了hSWI/SNF复合物，发现hSWI/SNF在G2-M阻断的细胞中不活跃。有丝分裂的hSWI/SNF含有Brg1，但不含hBrm，并且在至少两个亚基hSWI3和Brg1上磷酸化。在体外，来自异步细胞的活性hSWI/SNF可以被ERK1磷酸化和灭活，并通过去磷酸化重新激活。当hSWI/SNF的亚单位在体外或体内脱磷酸时，在细胞有丝分裂过程中分离的hSWI/SNF恢复活性。我们认为，hSWI/SNF的这种过渡性失活和再激活是在有丝分裂期间形成受抑制的染色质结构和在细胞离开有丝分裂时重组活性染色质结构所必需的。

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数字

图1
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纯化与标记Ini1相关的蛋白质。(一个)Flag标记的hSWI/SNF复合物的纯化。FL-Ini1-11核提取物用抗Flag M2亲和凝胶孵育，用含盐量增加的缓冲液多次洗涤后，用含有20倍摩尔过量Flag肽的缓冲液洗脱亲和柱上保留的蛋白质。然后在Superose 6分级柱上对洗脱的蛋白质进行分级。(B类)hSWI/SNF亚单位与FL-Ini1共分馏。用50μg核提取物（NE）进行Western blot分析；1.2μg亲和纯化SWI/SNF馏分（M2）和15μl施胶柱馏分14–23【Superose 6（Sup6）】。
图1
图1
纯化与标记Ini1相关的蛋白质。(一个)标记hSWI/SNF复合物的纯化。FL-Ini1-11核提取物用抗Flag M2亲和凝胶孵育，用含盐量增加的缓冲液多次洗涤后，用含有20倍摩尔过量Flag肽的缓冲液洗脱亲和柱上保留的蛋白质。然后在Superose 6分级柱上对洗脱的蛋白质进行分级。(B类)hSWI/SNF亚单位与FL-Ini1共分馏。用50μg核提取物（NE）进行Western blot分析；1.2μg亲和纯化SWI/SNF馏分（M2）和15μl施胶柱馏分14–23【Superose 6（Sup6）】。
图2
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标记hSWI/SNF复合物的生化特性。(一个)560 ng亲和纯化hSWI/SNF（M2，车道1)和465ng上浆柱级分Superose 6（sup6），泳道2]SDS-PAGE分析，银染显示蛋白质。(B类)核小体破坏活动。280 ng（车道4,5)或560 ng（车道6,7)M2组分与含或不含ATP的单核小体孵育。同样，155 ng（车道8,9)和310 ng（车道10月11日)如图所示，用核心粒子孵育Sup6峰组分。作为对照，裸体DNA（N，lane1)和带有或不带有ATP的核糖体DNA（车道2、3)如图所示。符号位于正确的表明hSWI/SNF以ATP依赖的方式引起的DNA酶敏感性变化。(C类)核小体阵列的重塑活性。增加M2:19 ng（车道4,5)，56 ng（车道6、7)，84 ng（车道8,9)，或Sup6分数：10 ng（车道10月11日)，31 ng（车道12,13)，62 ng（车道14,15)，与8 ng组装染色质模板孵育，如图所示。（车道1)线性质粒DNA（车道2、3)用或不用ATP孵育的组装模板。解析的DNA模板被超螺旋（Sc）；松弛和超螺旋（Sc.R）；线性（L）；和刻痕（N）。
图3
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有丝分裂hSWI/SNF被磷酸化，缺乏核小体破坏活性。(一个)hSWI/SNF亚单位在有丝分裂过程中受到不同的调节。指数生长细胞（异步）、S期细胞（S期）或前中期细胞（g期）中约10μg总蛋白2–M）用抗Brg1、抗hBrm、抗hSWI3或抗Flag抗血清进行Western blotting分析。如有指示，将蛋白质与10-20单位的小牛碱性磷酸酶（CIAP）在37°C下孵育45分钟。(B类)有丝分裂hSWI/SNF亚单位通过Superose 6（Sup6）分级柱共分馏。使用抗Brg1、抗hSWI3和抗Flag抗血清对Sup6柱馏分（fr.）15–27进行Western blot分析。有丝分裂hSWI/SNF亚基一致(n个 = 4） 洗脱晚于异步络合物（fr.19）。(C类)有丝分裂hSWI/SNF复合物是完整的。指数生长细胞（Asynch，fr.19）或早期有丝分裂阻滞细胞（G2–M，fr.23）通过SDS-PAGE和银染色进行分析。(D类)有丝分裂hSWI/SNF的磷酸酶处理使复合体能够破坏单核小体。来自异步细胞（500 ng）或G中阻滞细胞的类似数量的Sup6组分2-如图所示，M（560 ng）与含有或不含ATP和CIAP的单核小体孵育。
图3
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有丝分裂的hSWI/SNF被磷酸化，并且缺乏核小体破坏活性。(一个)hSWI/SNF亚单位在有丝分裂过程中受到不同的调节。指数生长细胞（异步）、S期细胞（S期）或前中期细胞（g期）中约10μg总蛋白2–M）用抗Brg1、抗hBrm、抗hSWI3或抗Flag抗血清通过蛋白质印迹进行分析。如有指示，蛋白质与10-20单位的小牛碱性磷酸酶（CIAP）在37°C下孵育45分钟。(B类)有丝分裂hSWI/SNF亚单位通过Superose 6（Sup6）分级柱共分馏。使用抗Brg1、抗hSWI3和抗Flag抗血清对Sup6柱馏分（fr.）15–27进行Western blot分析。有丝分裂hSWI/SNF亚基一致(n个 = 4） 洗脱晚于异步络合物（fr.19）。(C类)有丝分裂hSWI/SNF复合物是完整的。指数生长细胞（Asynch，fr.19）或早期有丝分裂阻滞细胞（G2–M，fr.23）通过SDS-PAGE和银染色进行分析。(D类)有丝分裂hSWI/SNF的磷酸酶处理使复合体能够破坏单核小体。来自异步细胞（500 ng）或G中阻滞细胞的类似数量的Sup6组分2-如图所示，M（560 ng）与含有或不含ATP和CIAP的单核小体孵育。
图3
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有丝分裂hSWI/SNF被磷酸化，缺乏核小体破坏活性。(一个)hSWI/SNF亚单位在有丝分裂过程中受到不同的调节。指数生长细胞（异步）、S期细胞（S期）或前中期细胞（g期）中约10μg总蛋白2–M）用抗Brg1、抗hBrm、抗hSWI3或抗Flag抗血清进行Western blotting分析。如有指示，蛋白质与10-20单位的小牛碱性磷酸酶（CIAP）在37°C下孵育45分钟。(B类)有丝分裂hSWI/SNF亚单位通过Superose 6（Sup6）分级柱共分馏。Sup6柱级分（fr.）15-27的蛋白质印迹分析，具有抗Brg1、抗hSWI3和抗Flag抗血清。有丝分裂hSWI/SNF亚基一致(n个 = 4） 洗脱晚于异步络合物（fr.19）。(C类)有丝分裂hSWI/SNF复合物是完整的。指数生长细胞（Asynch，fr.19）或早期有丝分裂阻滞细胞（G2–M，fr.23）通过SDS-PAGE和银染色进行分析。(D类)有丝分裂hSWI/SNF的磷酸酶处理使复合体能够破坏单核小体。来自异步细胞（500 ng）或G中阻滞细胞的类似数量的Sup6组分2-如图所示，M（560 ng）与含有或不含ATP和CIAP的单核小体孵育。
图3
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有丝分裂hSWI/SNF被磷酸化，缺乏核小体破坏活性。(一个)hSWI/SNF亚单位在有丝分裂过程中受到不同的调节。来自指数生长细胞（Asynch）、S期（S期）阻断的细胞或前中期阻断的细胞（g2–M）用抗Brg1、抗hBrm、抗hSWI3或抗Flag抗血清进行Western blotting分析。如有指示，蛋白质与10-20单位的小牛碱性磷酸酶（CIAP）在37°C下孵育45分钟。(B类)有丝分裂hSWI/SNF亚基通过蔗糖6（Sup6）定径柱共分馏。使用抗Brg1、抗hSWI3和抗Flag抗血清对Sup6柱馏分（fr.）15–27进行Western blot分析。有丝分裂hSWI/SNF亚基一致(n个 = 4） 洗脱晚于异步络合物（fr.19）。(C类)有丝分裂hSWI/SNF复合物是完整的。指数生长细胞（Asynch，fr.19）或早期有丝分裂阻滞细胞（G2–M，fr.23）通过SDS-PAGE和银染色进行分析。(D类)有丝分裂hSWI/SNF的磷酸酶处理使复合体能够破坏单核小体。来自异步细胞（500 ng）或G中阻滞细胞的类似数量的Sup6组分2-如图所示，M（560 ng）与含有或不含ATP和CIAP的单核小体孵育。
图4
图4
hSWI/SNF复合物的细胞周期依赖性再激活。(一个)指数增长的FL-Ini1细胞在G2–M通过诺康唑治疗，然后通过在无药物的培养基中清洗从块中释放。在指定时间（T）收获细胞，并通过FACS分析测定其DNA含量。为了进行比较，显示了指数增长细胞（Asynch）的DNA含量。小箭头表示细胞周期每个阶段的位置。(B类)hSWI/SNF亚单位的细胞周期依赖性去磷酸化。hSWI/SNF复合物是从异步细胞（Asynch）或G封闭细胞中亲和纯化的2–M，然后释放（T=0、1、2、3、5和24），然后检查hSWI/SNF组分的蛋白质组成和磷酸化状态。用抗Brg1、抗hBrm或抗hSWI3蛋白免疫印迹法分析每个组分中约200 ng的成分。(C类)hSWI/SNF活化与其亚单位的去磷酸化相关。等量（200 ng）来自异步细胞（通道）的亲和纯化hSWI/SNF部分3,4)，G中的单元格被阻止2–M（车道5,6)，或从块（车道）释放的单元格7–16)使用8ng组装模板测试染色质重塑活性，如图所示，添加或不添加ATP。刻痕闭合圆（N）；线性（L）；超螺旋（Sc）；以及超螺旋和松弛（Sc.R）质粒DNA。
图5
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活性hSWI/SNF在体外受到ERK1的抑制。(一个)Brg1、hBrm和hSWI3在体外被GST–ERK1磷酸化。GST–His–MEK1（0.25μg/15μl反应）激活等量的野生型GST–ERK1或突变型GST-ERK1（K63M），如材料和方法所述。在含有GST–ERK1（通道）的反应中添加了大约200 ng异步SWI/SNF2)或GST–ERK1（K63M）（车道三). 样品在30°C下培养1小时，并通过Western blotting进行分析。添加PP2A时（车道4)通过向反应中添加GST珠去除GST融合蛋白，上清液与0.1单位PP2A在30°C下孵育1小时。作为对照，显示异步hSWI/SNF亚基（通道1,5). (B类)ERK1体外磷酸化的hSWI/SNF是不活跃的。培养异步hSWI/SNF组分（条件如一个)如图所示，MEK1激活或不激活GST-ERK1和GST-ERK1（K63M）。作为对照，hSWI/SNF在与GST–MEK1（通道5)，GST–ERK1（车道6)或GST–ERK1（K63M）（车道7). 添加PP2A时（车道10–15)，样品按照一个分析如图4所示。(C类)含Brg1的络合物可通过PP2A有效活化。从呈指数增长的细胞中纯化的hSWI/SNF组分（异步），细胞在G2–M（T=0）或细胞被阻断然后释放（T=1），用含有或不含ATP和PP2A的超螺旋模板培养，如图所示。当加入PP2A时，将样品与0.1单位的PP2A在30°C下预孵育1小时。
图5
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体外ERK1抑制活性hSWI/SNF。(一个)Brg1、hBrm和hSWI3在体外被GST–ERK1磷酸化。GST–His–MEK1（0.25μg/15μl反应）激活等量的野生型GST–ERK1或突变型GST-ERK1（K63M），如材料和方法所述。在含有GST–ERK1（通道）的反应中添加了大约200 ng异步SWI/SNF2)或GST–ERK1（K63M）（车道三). 样品在30°C下培养1小时，并通过Western blotting进行分析。添加PP2A时（车道4)通过向反应中添加GST珠去除GST融合蛋白，上清液与0.1单位PP2A在30°C下孵育1小时。作为对照，显示异步hSWI/SNF亚基（通道1,5). (B类)ERK1体外磷酸化的hSWI/SNF是不活跃的。培养异步hSWI/SNF组分（条件如一个)如图所示，MEK1激活或不激活GST–ERK1和GST–ERK1（K63M）。作为对照，hSWI/SNF在与GST–MEK1（通道5)，GST–ERK1（车道6)，或GST–ERK1（K63M）（车道7). 添加PP2A时（车道10–15)，样品按照一个分析如图4所示。(C类)含Brg1的络合物可通过PP2A有效活化。从呈指数增长的细胞中纯化的hSWI/SNF组分（异步），细胞在G2–M（T=0）或细胞被阻断然后释放（T=1），用含有或不含ATP和PP2A的超螺旋模板培养，如图所示。添加PP2A后，将样品与0.1单位的PP2A在30°C下预培养1小时。
图5
图5
体外ERK1抑制活性hSWI/SNF。(一个)Brg1、hBrm和hSWI3在体外被GST–ERK1磷酸化。GST–His–MEK1（0.25μg/15μl反应）激活等量的野生型GST–ERK1或突变型GST-ERK1（K63M），如材料和方法所述。在含有GST–ERK1（通道）的反应中添加了大约200 ng异步SWI/SNF2)或GST–ERK1（K63M）（车道三). 样品在30°C下培养1小时，并通过Western blotting进行分析。添加PP2A时（车道4)通过向反应中添加GST珠去除GST融合蛋白，上清液与0.1单位PP2A在30°C下孵育1小时。作为对照，显示异步hSWI/SNF亚基（通道1,5). (B类)ERK1体外磷酸化的hSWI/SNF是不活跃的。将异步hSWI/SNF级分孵育（条件如一个)如图所示，MEK1激活或不激活GST-ERK1和GST-ERK1（K63M）。作为对照，hSWI/SNF在与GST–MEK1（通道5)，GST–ERK1（车道6)或GST–ERK1（K63M）（车道7). 添加PP2A时（车道10–15)，样品按照一个分析如图4所示。(C类)含Brg1的络合物可通过PP2A有效活化。从呈指数增长的细胞中纯化的hSWI/SNF组分（异步），细胞在G2–M（T=0）或细胞被阻断然后释放（T=1），用含有或不含ATP和PP2A的超螺旋模板培养，如图所示。添加PP2A后，将样品与0.1单位的PP2A在30°C下预培养1小时。
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