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.1998年3月9日；140(5):1211-25.
doi:10.1083/jcb.140.5.1211。

磷脂酰肌醇3-激酶和胰岛素受体底物-1在脂肪细胞中的细胞内定位：膜骨架的潜在参与

S F克拉克 1, S马丁, A J卡罗齐, M M希尔, D E詹姆斯
附属公司

磷脂酰肌醇3-激酶和胰岛素受体底物-1在脂肪细胞中的细胞内定位：膜骨架的潜在参与

S F克拉克等。 J细胞生物学. .

摘要

磷脂酰肌苷（PI）3-激酶与胰岛素处理的脂肪细胞中的酪氨酸磷酸化胰岛素受体底物-1（IRS-1）结合，这一步骤在葡萄糖转运蛋白GLUT4从细胞内小泡到细胞表面的调节运动中起着中心作用。PDGF也激活脂肪细胞中的PI3-激酶，对这些细胞中的GLUT4运输没有显著影响。我们认为，这种特异性可能通过PI3-激酶对胰岛素和PDGF激活的差异定位介导。通过对3T3-L1脂肪细胞进行亚细胞分离，我们发现胰岛素和PDGF刺激的PI 3-激酶活性分别位于细胞内高速颗粒（HSP）和质膜（PM）中。HSP还富含IRS-1、胰岛素刺激的酪氨酸磷酸化IRS-1和细胞内含有GLUT4的小泡。利用蔗糖密度梯度沉淀，我们已经能够将热休克蛋白分离为两个单独的亚组分：一个富含IRS-1、酪氨酸磷酸化IRS-1和PI 3-激酶以及细胞骨架元素，另一个富含膜，包括细胞内GLUT4小泡。用非离子洗涤剂处理热休克蛋白，可以释放所有膜成分，而IRS-1和PI 3-激酶仍然不溶。相反，在高离子强度下，膜保持完整，而IRS-1和PI 3-激酶可自由溶解。我们进一步证明，IRS-1-PI 3-激酶复合物存在于过度表达IRS-1的CHO细胞中，在这些细胞中，IRS-1和PI 3-激酶的细胞溶质池在与链球菌溶血素-O通透性化后释放，而这些蛋白质的颗粒部分被保留。这些数据表明，IRS-1、PI 3-激酶以及其他信号中间体可能形成与肌动蛋白细胞骨架相关的预组装复合物。这种复合物必须紧贴细胞表面，从而能够接触到胰岛素受体，以及可能以某种方式赋予这些细胞中胰岛素信号绝对特异性的其他信号分子。

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数字

图1
图1
胰岛素和PDGF对脂肪细胞GLUT4易位的影响。将培养在盖玻片上的3T3-L1脂肪细胞置于基础状态，并与胰岛素（1μM）或PDGF（100 ng/ml）孵育，或不添加(控制)在37°C下保持15分钟。对细胞进行清洗和超声波处理，以产生质膜碎片（PM草坪）。用抗GLUT4抗体对PM草坪进行免疫标记，并用免疫荧光显微镜观察。所示结果代表了三个独立的实验。
图2
图2
胰岛素和PDGF对PI 3-激酶活性的影响。来自与胰岛素孵育的3T3-L1脂肪细胞的全细胞裂解物(我; 1μM）或PDGF(P（P）; 100 ng/ml）或不添加(C类)，进行免疫沉淀(IP（IP）)使用抗磷酸酪氨酸抗体(抗pY). 然后对免疫沉淀物进行SDS-PAGE和抗p85免疫印迹聚丙烯腈多克隆抗体(顶部面板)或以磷脂酰肌醇为底物分析PI 3-激酶活性(底部面板). 将放射性标记产物磷脂酰肌醇3′-磷酸（PIP）从未合并的放射性标记中分离出来(原产地)使用薄层色谱法。在四个独立的实验中也得到了类似的结果。
图3
图3
胰岛素和PDGF对PI3-激酶活性亚细胞分布的影响。将脂肪细胞置于基础状态并与胰岛素孵育(我)或PDGF(P（P）)或不添加(C类). 然后将细胞均质并进行差速离心，以获得富含质膜的组分(颗粒物)内质网和内质体标记物(HDM公司)，胞浆(中青旅)和高速颗粒分数(热休克蛋白). 每个分数的等分(颗粒物25微克；热休克蛋白100微克；HDM公司75微克；中青旅200μg）分别代表整个细胞中这些组分的平均3/5、2/5、3/5和1/20，使用抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫沉淀(抗pY). 然后使用免疫沉淀物测量(A类)PI 3-激酶活性，或(B)使用多克隆抗p85的免疫反应性p85聚丙烯腈抗体。PI3-激酶活性在亚细胞组分中分布的定量如所示(C类). 胰岛素各部分中的总PI 3-激酶活性(▪), 与PDGF（□）相比，计算处理细胞，并在减去基础值后表示为总细胞的百分比。显示了三个独立实验的平均值（±SEM）。项目实施计划，磷脂酰肌醇3′-磷酸。
图3
图3
胰岛素和PDGF对PI3-激酶活性亚细胞分布的影响。将脂肪细胞置于基础状态并与胰岛素孵育(我)或PDGF(P（P）)或不添加(C类). 然后将细胞均质并进行差速离心，以获得富含质膜的组分(颗粒物)内质网和内质体标记物(HDM公司)，胞浆(中青旅)和高速颗粒分数(热休克蛋白). 每个分数的等分(颗粒物25微克；热休克蛋白100微克；HDM公司75微克；中青旅200μg）分别代表整个细胞中这些组分的平均3/5、2/5、3/5和1/20，使用抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫沉淀(抗pY). 然后使用免疫沉淀物测量(A类)PI 3-激酶活性，或(B)使用多克隆抗p85的免疫反应性p85聚丙烯腈抗体。PI3-激酶活性在亚细胞组分中分布的定量如所示(C类). 胰岛素各部分中的总PI 3-激酶活性(▪), 与PDGF（□）相比，计算处理细胞，并在减去基础值后表示为总细胞的百分比。显示了三个独立实验的平均值（±SEM）。项目实施计划，磷脂酰肌醇3′-磷酸。
图3
图3
胰岛素和PDGF对PI3-激酶活性亚细胞分布的影响。将脂肪细胞置于基础状态并与胰岛素孵育(我)或PDGF(P（P）)或不添加(C类). 然后将细胞均质并进行差速离心，以获得富含质膜的组分(颗粒物)内质网和内质体标记物(HDM公司)，胞浆(中青旅)和高速颗粒分数(热休克蛋白). 每个分数的等分(颗粒物25微克；热休克蛋白100微克；HDM公司75微克；中青旅200μg）分别代表整个细胞中这些组分的平均3/5、2/5、3/5和1/20，使用抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫沉淀(抗pY). 然后使用免疫沉淀物测量(A类)PI 3-激酶活性，或(B)使用多克隆抗p85的免疫反应性p85聚丙烯腈抗体。PI3-激酶活性在亚细胞组分中分布的定量如所示(C类). 胰岛素各部分中的总PI 3-激酶活性(▪), 与PDGF（□）相比，计算处理细胞，并在减去基础值后表示为总细胞的百分比。显示了三个独立实验的平均值（±SEM）。项目实施计划，磷脂酰肌醇3′-磷酸。
图4
图4
胰岛素与PDGF对3T3-L1脂肪细胞中PI3-激酶和酪氨酸磷酸化蛋白亚细胞分布的影响。脂肪细胞被带到基底部并与胰岛素孵育(我)，或PDGF(P（P）)，或不添加(C类). 将细胞清洗、均质并制备亚细胞组分。用SDS-PAGE分析每一组分（25μg蛋白质）的等分样品，并用特异性抗体进行免疫印迹(A类)PI 3-激酶的p85亚单位(抗p85聚丙烯腈)或(B)磷酸酪氨酸(抗pY). 使用胰岛素或PDGF的HDM中p85的分布没有显著变化（未显示）。使用此程序（未显示）无法在胞浆中检测到酪氨酸磷酸化。结果代表了两个实验。
图4
图4
胰岛素与PDGF对3T3-L1脂肪细胞中PI3-激酶和酪氨酸磷酸化蛋白亚细胞分布的影响。脂肪细胞被带到基底部并与胰岛素孵育(我)，或PDGF(P（P）)，或不添加(C类). 将细胞清洗、均质并制备亚细胞组分。用SDS-PAGE分析每一组分（25μg蛋白质）的等分样品，并用特异性抗体进行免疫印迹(A类)PI 3-激酶的p85亚单位(抗p85聚丙烯腈)或(B)磷酸酪氨酸(抗pY). 使用胰岛素或PDGF的HDM中p85的分布没有显著变化（未显示）。使用此程序（未显示）无法在胞浆中检测到酪氨酸磷酸化。结果代表了两个实验。
图5
图5
基础和胰岛素处理条件下脂肪细胞中IRS-1、Grb2、mSos和Shc亚型的亚细胞分布。将脂肪细胞置于基础状态，并在37°C下，在缺少（−）或存在（+）胰岛素（1μM）的情况下培养15分钟。将细胞清洗、均质并制备亚细胞组分。每部分（25μg蛋白质）的等分样品，质膜(颗粒物)，胞浆(中青旅)，高速颗粒(热休克蛋白)和高密度微粒体(HDM公司)通过SDS-PAGE分析组分，并分别用IRS-1、Grb2、mSos或Shc特异性抗体进行免疫印迹。所示结果代表了两个独立的实验。
图6
图6
非离子洗涤剂和高离子强度对脂肪细胞高速颗粒（HSP）组分的影响。将脂肪细胞置于基础状态，在没有或存在胰岛素（1μM）的情况下培养，然后进行差速离心以产生HSP部分。HSP在缓冲液（Hepes，pH 7.4，1 mM EDTA，250 mM蔗糖）或含有1%Triton X-100的相同缓冲液中培养(T型x个-100)，60 mMβ-辛基葡萄糖苷(β-OG)，1.0 M NaCl或0.5 M NaCl.，在4°C下放置1 h，然后在175000下进行离心g。用SDS-PAGE分析所得微丸，并用IRS-1、磷酸酪氨酸特异性抗体进行免疫印迹(抗pY)，PI 3-激酶(抗p85聚丙烯腈)GLUT4和γ-adaptin。结果代表了三个独立的实验。
图7
图7
脂肪细胞制备的高速颗粒（HSP）组分的浮选分析。未经处理的HSP亚细胞部分（A）)或胰岛素治疗(B和C类)制备脂肪细胞并将其重新悬浮在最终体积为1 ml的含60%蔗糖的缓冲液（Hepes，pH 7.4，1 mM EDTA）中。该部分依次覆盖有含50%、30%和10%蔗糖的缓冲溶液（1 ml）和含5%蔗糖的400μl缓冲液。然后在90000下离心蔗糖梯度克持续18小时。从底部收集馏分（400μl）(1–11)重力梯度和颗粒(P（P）)在400μl缓冲液中溶解。每一组分的等分样品用于测量总蛋白含量或用IRS-1、磷酸酪氨酸特异性抗体进行免疫印迹(抗pY)PI 3-激酶(抗p85聚丙烯腈)或GLUT4。(C类)用抗磷酸酪氨酸抗体免疫沉淀每个组分（100μl）的等分样品，并检测PI 3-激酶活性。每个免疫沉淀物中存在的放射性标记产物PIP通过TLC进行解析(插入)通过闪烁计数进行量化。显示的结果描述了从颗粒免疫沉淀的PI3-激酶活性的百分比(P（P）)和分数(1–7)相对于整个梯度中的总活性。组分8–11的免疫沉淀物在整个梯度中的PI 3-激酶总活性小于1%，未显示。结果代表了两个独立的实验。
图7
图7
脂肪细胞制备的高速颗粒（HSP）组分的浮选分析。未经处理的HSP亚细胞部分（A）)或胰岛素治疗(B和C类)制备脂肪细胞并将其重新悬浮在最终体积为1 ml的含60%蔗糖的缓冲液（Hepes，pH 7.4，1 mM EDTA）中。该部分依次覆盖有含50%、30%和10%蔗糖的缓冲溶液（1 ml）和含5%蔗糖的400μl缓冲液。然后在90000下离心蔗糖梯度克持续18小时。从底部收集馏分（400μl）(1–11)重力梯度和颗粒(P（P）)在400μl缓冲液中溶解。每一组分的等分样品用于测量总蛋白含量或用IRS-1、磷酸酪氨酸特异性抗体进行免疫印迹(抗pY)PI 3-激酶(抗p85聚丙烯腈)或GLUT4。(C类)用抗磷酸酪氨酸抗体免疫沉淀每个组分（100μl）的等分样品，并检测PI 3-激酶活性。每个免疫沉淀物中存在的放射性标记产物PIP通过TLC进行解析(插入)通过闪烁计数进行量化。显示的结果描述了从颗粒免疫沉淀的PI3-激酶活性的百分比(P（P）)和分数(1–7)相对于整个梯度中的总活性。组分8–11的免疫沉淀物在整个梯度中的PI 3-激酶总活性小于1%，未显示。结果代表了两个独立的实验。
图7
图7
脂肪细胞制备的高速颗粒（HSP）组分的浮选分析。未经处理的HSP亚细胞部分（A）)或胰岛素治疗(B和C类)制备脂肪细胞并将其重新悬浮在最终体积为1 ml的含60%蔗糖的缓冲液（Hepes，pH 7.4，1 mM EDTA）中。该部分依次覆盖有含50%、30%和10%蔗糖的缓冲溶液（1 ml）和含5%蔗糖的400μl缓冲液。然后在90000下离心蔗糖梯度克持续18小时。从底部收集馏分（400μl）(1–11)重力梯度和颗粒(P（P）)在400μl缓冲液中溶解。每一组分的等分样品用于测量总蛋白含量或用IRS-1、磷酸酪氨酸特异性抗体进行免疫印迹(抗pY)PI 3-激酶(抗p85聚丙烯腈)或GLUT4。(C类)用抗磷酸酪氨酸抗体免疫沉淀每个组分（100μl）的等分样品，并检测PI 3-激酶活性。每个免疫沉淀物中存在的放射性标记产物PIP通过TLC进行解析(插入)通过闪烁计数进行量化。显示的结果描述了从颗粒免疫沉淀的PI3-激酶活性的百分比(P（P）)和分数(1–7)相对于整个梯度中的总活性。组分8–11的免疫沉淀物在整个梯度中的PI 3-激酶总活性小于1%，未显示。结果代表了两个独立的实验。
图8
图8
蔗糖梯度离心后IRS-1和PI 3-激酶的再沉积。如图7所示，对来自胰岛素处理细胞的HSP部分进行浮选分析。馏分1(一层楼)和2(地上二层)用缓冲液（20mM Hepes，pH 7.4，1mM EDTA）等渗，并在175000下离心克1小时15分钟。相应的颗粒(第1页和第2页)以及等量的起始分数(一层楼和地上二层)，进行SDS-PAGE并用IRS-1和PI 3-激酶的特异性抗体进行免疫印迹(抗p85聚丙烯腈). 使用从基底细胞分离的热休克蛋白也获得了相同的结果，但未显示。
图9
图9
3T3-L1脂肪细胞热休克蛋白沉积速度分析。从基底细胞获得的热休克蛋白分数(A类)，或胰岛素处理的脂肪细胞(B)将其重新悬浮在含有5%蔗糖的缓冲液（20 mM Hepes，pH 7.4，1 mM EDTA，200μl）中，并覆盖到5–30%的连续蔗糖梯度上。梯度在90000下离心克90分钟，从底部收集馏分（400μl）(1–11)重力作用下的每个梯度。对每个组分的等分样品进行蛋白质含量分析，或通过SDS-PAGE（30μl）进行解析，并使用IRS-1、磷酸酪氨酸特异性抗体进行免疫印迹(抗pY)，PI 3-激酶(抗p85聚丙烯腈)，和GLUT4。结果代表了两个独立的实验。
图9
图9
3T3-L1脂肪细胞热休克蛋白沉积速度分析。从基底细胞获得的热休克蛋白分数(A类)，或胰岛素处理的脂肪细胞(B)将其重新悬浮在含有5%蔗糖的缓冲液（20 mM Hepes，pH 7.4，1 mM EDTA，200μl）中，并覆盖到5–30%的连续蔗糖梯度上。梯度在90000下离心克90分钟，从底部收集馏分（400μl）(1–11)重力作用下的每个梯度。对每个组分的等分样品进行蛋白质含量分析，或通过SDS-PAGE（30μl）进行解析，并使用IRS-1、磷酸酪氨酸特异性抗体进行免疫印迹(抗pY)，PI 3-激酶(抗p85聚丙烯腈)，和GLUT4。结果代表了两个独立的实验。
图11
图11
IRS-1和PI 3-激酶在渗透性CHO细胞中的保留。将过度表达IR和IRS-1的CHO细胞置于基础状态，然后在没有（−）或存在（+）链球菌溶血素的情况下培养-O（运行）(SLO公司)使细胞穿孔。将细胞清洗、均质并进行差速离心以获得高速颗粒(热休克蛋白)和胞质(中青旅)分数。对每一组分的等分样品（15μg蛋白质）进行SDS-PAGE，并用IRS-1和PI 3-激酶特异性抗体进行免疫印迹(抗p85聚丙烯腈).
图10
图10
CHO/IR/IRS–1细胞HSP沉积速度分析。从基底细胞获得的热休克蛋白分数(A类)或胰岛素治疗(B)将过度表达胰岛素受体（IR）和IRS-1的CHO细胞重新悬浮在含有5%蔗糖的缓冲液（20 mM Hepes，pH 7.4，1 mM EDTA，200μl）中，并覆盖在5–30%的连续蔗糖梯度上。梯度在90000下离心克90分钟，从底部收集馏分（400μl）(1–11)重力作用下的每个梯度。对每个组分的等分样品进行蛋白质含量分析，或通过SDS-PAGE（30μl）进行解析，并使用IRS-1、磷酸酪氨酸特异性抗体进行免疫印迹(抗pY)和PI 3-激酶(抗p85聚丙烯腈).
图10
图10
CHO/IR/IRS–1细胞HSP沉积速度分析。从基底细胞获得的热休克蛋白分数(A类)或胰岛素治疗(B)将过度表达胰岛素受体（IR）和IRS-1的CHO细胞重新悬浮在含有5%蔗糖的缓冲液（20 mM Hepes，pH 7.4，1 mM EDTA，200μl）中，并覆盖在5–30%的连续蔗糖梯度上。梯度在90000下离心克90分钟，从底部收集馏分（400μl）(1–11)重力作用下的每个梯度。对每个组分的等分样品进行蛋白质含量分析，或通过SDS-PAGE（30μl）进行解析，并使用IRS-1、磷酸酪氨酸特异性抗体进行免疫印迹(抗pY)和PI 3-激酶(抗p85聚丙烯腈).
图12
图12
从脂肪细胞中鉴定热休克蛋白组分中的丝状网络束以及该组分中不溶于洗涤剂的成分。如图9所示，通过蔗糖梯度对来自基底脂肪细胞的HSP部分进行速度沉降分析。将富含GLUT4（分数5-7）或IRS-1/PI 3-激酶（分数8-10）的分数合并，并通过在缓冲液中稀释（20 mM Hepes，pH 7.4，1 mM EDTA）使其等渗，然后进行高速离心。将此步骤产生的颗粒重新悬浮在PBS中，然后固定在2%多聚甲醛/PBS中，并进行电子显微镜分析。从富集于(A类)IRS-1/PI 3-激酶和(B)图示为GLUT4。在单独的实验中(C类)T型x个-制备热休克蛋白部分的100不溶性成分，并将其固定在2%多聚甲醛/PBS中，并进行电子显微镜分析。棒材，200 nm。
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参考文献

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