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.2017年7月5日；25（7）：1011-1024.e4。
doi:10.1016/j.str.2017.05.005。 Epub 2017年6月8日。

转化生长因子β信号调节剂SARA/Endofin与HD-PTP特异性相互作用的结构基础

Deepankar Gahloth公司 1, 科林·利维 1, 路易丝·沃克 1, 莉迪亚·旺德利 1, 保罗模具 1, 桑德拉泰勒 1, 菲利普·伍德曼 2, 莉迪亚·塔伯内罗 三
附属公司

转化生长因子β信号调节剂SARA/Endofin与HD-PTP特异性相互作用的结构基础

Deepankar Gahloth公司等。 结构. .

摘要

SARA和endofin是通过配体激活的转化生长因子β/骨形态发生蛋白（TGFβ/BMP）受体驱动Smad磷酸化的内体衔接蛋白。我们在这项研究中显示，SARA和内皮素也招募肿瘤抑制因子HD-PTP，这是一种内体分选和ESCRT依赖性受体下调的主调节因子。SARA/内皮素N末端和HD-PTP Bro1结构域中结合CHMP4/ESCRT-III的保守疏水区域之间发生高亲和力相互作用。CHMP4结合是Bro1蛋白的普遍特征，但SARA/内膜结合是HD-PTP特有的。HD-PTP的结晶结构兄弟1与严重急性呼吸系统综合征、内啡肽和三种CHMP4亚型的复合物显示，所有配体与保守位点的结合相似，但关键的是，只有严重急性呼吸系统综合征/内啡肽在HD-PTP特有的相邻口袋中相互作用。这些结构，连同突变和结合分析，解释了SARA/内切芬的高亲和力和特异性结合，以及为什么它们与CHMP4如此有效地竞争。我们的数据调用了TGFβ/BMP信号的内吞调节是如何控制的模型。

关键词：ESCRT-III；SARA与内脏；TGFβ信号转导；晶体结构；内体效应器；肿瘤抑制磷酸酶。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
HD-PTP在内切体（A）顶端与Smad调节因子SARA和Endofin结合：HD-PTP的结构域组织（CC，线圈结构域；PRR，富含脯氨酸区域；PTP，蛋白质酪氨酸磷酸酶结构域）。底部：内切芬和SARA的结构域组织（FYVE、Fab1、YOTB、Vac1和EEA1锌指结构域；SBD、Smad结合结构域；PRR、脯氨酸富集区）。灰色部分是Y2H屏幕识别出的内脏和SARA上的最小HD-PTP相互作用区域；黑色表示预测会形成α螺旋的N末端22残基区域，序列如下所示，相同残基以粗体突出显示。（B） Y2H测定显示内鳍和严重急性呼吸系统综合征与HD-PTP相互作用佛罗里达州（全长）或HD-PTP浏览器1-CC，但不使用Alix浏览器1-V将酵母细胞与已鉴定的猎物结构体和全长内酯或SARA诱饵结构体进行三次转化，并选择在QDO板上进行相互作用。（C） HA-HD-PTP共同免疫沉淀来自细胞裂解物的内源性内切酶和SARA。（D和E）内切酶-myc（D）或SARA-myc（E）的共表达将HA-HD-PTP重新分配到放大的myc标记的内切酶体上（箭头所示）。左侧面板是示例图像；右侧面板是三个独立实验的定量结果（平均值±标准偏差）。比例尺，10μm。
图2
图2
绘制Endofin（1-84）构建体或Endofin（85-1539）和HD-PTP之间HD-PTP与严重急性呼吸系统综合征和Endofin（A）的结合相互作用Y2H测定佛罗里达州或HD-PTP浏览器1-CC表明结合仅限于内脏N末端，内脏L15对结合很重要。数据来自一式三份的代表性实验。（B） 体外翻译内皮素1–84-链球菌与细菌表达的His共同免疫沉淀，但不是内皮素（1–84/L15P）链球菌6-HD-PTP（HD-PTP）浏览器1-CC在与抗-His孵育后6抗体；（i） 是一个示例实验，（ii）是三个独立实验的定量（平均值±SD）。（C） HD-PTP的生物传感器结合等温线科科斯群岛和HD-PTP浏览器1-CC与内环和SARA 22肽结合，用于确定结合亲和力（HD-PTP兄弟1和HD-PTP浏览器1-CC与内环肽的结合具有KD类分别为3.1±0.1微米和2.7±0.1微米，以及HD-PTP兄弟1具有KD类11.3±0.3μM至SARA）。（D） 生物传感器传感图显示内鳍肽与Alix缺乏结合兄弟1。（E和F）感官图显示，内脏L15到脯氨酸的突变消除了与HD-PTP的结合兄弟1（E） 和HD-PTP浏览器1-CC（F） 与野生型内切酶肽对照实验进行比较。
图3
图3
内皮素和CHMP4B竞争与HD-PTP（A）的Bro1结构域的结合。与野生型HA-HD-PTP相比，当共同转染时，HA-HD-PT（I202D，L206D）不被招募到富含内皮素-myc的内体中。比例尺，10μm。（B） 如生物传感器传感器图中所示，与缓冲液对照相比，l202D突变会破坏内环肽的结合。（C） 细菌表达的GST-CHMP4B与细菌表达的His共同免疫沉淀6-高密度聚乙烯浏览器1-CC用抗-His药物孵育后6抗体。这是通过包含内翅片来防止的1-22（WT），但不通过内脏1–22（L15P）（i）是一个示例实验，（ii）是三个独立实验的定量（平均值±SD）。使用未配对t检验和Welch校正进行统计分析：∗∗∗p<0.001；ns，不显著。（D） 使用CHMP4毒饵和HD-PTP或Alix猎物构建物进行的Y2H分析表明，CHMP4B与HD-PTP之间的相互作用Bro1抄送和Alix浏览器1-V需要CHMP4B C端六个氨基酸。（E） 用抗-His抗体共免疫沉淀细菌表达的蛋白质表明，与His结合6-HD-PTP（HD-PTP）浏览器1-CC通过删除GST-CHMP4B的C末端六个氨基酸来阻止。三个独立实验的代表。（F） HD-PTP的生物传感器结合等温线兄弟1CHMP4肽与K的亲和力相似D类CHMP4A、B和C分别为132±7.0μM、85±2μM和88±1μM。生物传感器实验至少进行了三次。误差条表示SEM。
图4
图4
HD-PTP的结晶结构兄弟1带内体效应器（A）的带状图显示HD-PTP复合物的结构兄弟1左边是SARA（黄色）和内啡肽（褐藻），右边是三种CHMP4亚型肽（4A，橙色；4B，绿色；4C，紫色）。所有肽都形成螺旋结构，并结合到Bro1结构域的凹面区域。（B） 本研究中确定的六种结构的表面表征，显示肽为α螺旋带，Bro1结构域为分子表面（灰色）。中的彩色区域阿波罗-HD-PTP结构突出了共同的CHMP4结合位点（绿色）和特定的S位点（洋红色），仅被SARA/内环肽利用。肽的颜色编码如（A）所示。（C） Bro1结构域中涉及在（B）所示结构中的公共和特定位置与效应肽结合的残基。Bro1蛋白之间的保守残基以黑色显示，取代以红色显示。不同的结合位点被标记（公共位点和S位点），CHMP4肽（绿色）和SARA/内啡肽（褐飞虱）之间的界面范围被突出显示。
图5
图5
HD-PTP分析兄弟1-CHMP4接口（A）三个HD-PTP结构的带状表示兄弟1-CHMP4络合物（4A，橙色；4B，绿色；4C紫色）在HD-PTP疏水凹面区域的共同结合位点显示界面兄弟1肽侧链显示为棒状。结晶中使用的每个肽的序列如下所示，其中结构中可见的残基用下划线表示，疏水残基用黑色表示，酸性/极性残基用红色表示。（B）显示HD-PTP中残基的结合位点的详细信息兄弟1（黑色标签）与肽中保守的亮氨酸和色氨酸残基形成相互作用（根据每个肽的色码进行标记）。（C） HD-PTP的表面表示兄弟1三个肽重叠显示结合到两个疏水囊和HD-PTP兄弟1残留物涉及C末端区域（左侧）和公共部位（右侧），标记为黑色。（D） HD-PTP之间静电相互作用的详细信息兄弟1R198和CHMP4肽中的酸性和极性残基。（E） 结构的表面表示阿波罗-HD-PTP（HD-PTP）兄弟1CHMP4B肽重叠（左），HD-PTP兄弟1-CHMP4B复合体（中心）和HD-PTP兄弟1-SARA综合体（右）。橙色的残留物和黑色的标签是用来堵塞阿波罗结构，并在与肽的复合物中进行构象重排。相比之下，S站点包在阿波罗结构。
图6
图6
HD-PTP接口分析兄弟1用SARA和Endofin（A）带状表示HD-PTP的结构兄弟1-SARA（黄色）和HD-PTP兄弟1-内脏（fuschia）复合物。绑定接口非常广泛，涵盖了常见的CHMP4绑定位点和唯一的特定S位点。结合位点中的螺旋被标记。以下是结晶中使用的两种肽的序列，其中结构中可见的残基被划线，在公共位点形成相互作用的残基为绿色，与S位点结合的残基则为洋红色。（B） HD-PTP详图兄弟1-公共位点的SARA/endofin界面，显示了来自SARA/endoffin的保守L12、L16和F19残基（黑色背景上的彩色标签）与来自HD-PTP的关键L202/I206残基（Doyotte等人，2008）和L189残基的相互作用兄弟1（黑色标签）。（C） HD-PTP的表面表示兄弟1-SARA结构与SARA/内环肽重叠。HD-PTP用黑色标记兄弟1在Bro1结构域的C末端区域（左侧）和公共位点（右侧）参与与肽相互作用的残基，以黑色标记。根据每个肽的色码，标记SARA/内脏中的两个保守Phe残基。（D） S位点的详细信息，显示参与相互作用的所有残基。配色方案如（B）所示。（E） HD-PTP中的碱性残基与SARA/内吞中的酸性残基之间的静电相互作用的详细信息。配色方案如（B）所示。
图7
图7
绘制HD-PTP S站点的接口（A）详图兄弟1-显示T145位置的内环复合体，T145是结合界面上的关键残基。相关Bro1蛋白上的同源残基（青色Alix中的K151；绿色Brox中的R145）更大，显然会与内鳍肽发生冲突，这解释了观察到的结合选择性。（B） HD-PTP详图兄弟1-内切酶结合界面显示突变评估中使用的残基位置，标记为黑色。（C） 生物传感器结合研究证实了SARA和内酯肽N末端保守MXYF区域的重要性。缺乏这些残基的内环肽与HD-PTP结合不良兄弟1和HD-PTP浏览器1-CC与野生型内酯肽形成对比。（D） HA-HD-PTP浏览器1-CC或在细胞中表达所指示的突变体，并用抗内皮素抗体检测抗HA免疫沉淀物。左侧面板显示了一个示例实验，代表了三个独立的实验。输入显示在底部面板中，抗HA免疫沉淀（IP）如上所示。星号表示可能的内切酶裂解产物缺乏N末端，或内切酶抗体识别的交叉反应物种。该物种存在于细胞裂解物中，但不存在于抗HA IP中。右侧面板显示了四个独立实验的定量结果（平均值±标准偏差）。使用未配对t检验和Welch校正进行统计分析：∗∗∗∗p<0.0001，∗∗∗p<0.001，∗∗p<0.01，∗p<0.05；ns，不显著。（E） 细菌表达的GST或GST-CHMP4B与His-HD-PTP联合免疫共沉淀表明，与GST-CHMP4B的结合不受His中T145-K突变的影响6-高密度聚乙烯浏览器1-CC三个独立实验的代表。
图8
图8
TGFβ/BMP信号的细胞内调节模型通过配体结合激活TGFβ家族受体（i）导致受体寡聚体的形成、受体磷酸化和内化（ii）。当激活的受体复合物靶向内体时，它们会招募SARA/内啡肽（iii），它们结合HD-PTP Bro1结构域，以防止受体参与ESCRT途径。SARA/endofin将R-Smad招募到受体复合物（iv）中，导致R-Smad磷酸化并随后与co-Smad、Smad4结合，从而实现转录调控。去磷酸化受体要么不能与SARA/endofin结合，要么从SARA/endoffin中释放出来，从而使HD-PTP招募CHMP4/ESCRT-III（v），以靶向ILV受体（vi），最终导致溶酶体降解。HD-PTP和ESCRT-0之间的相互作用可能在CHMP4招募之前提供一个中间步骤，并且受体泛素化可能促进其与ESCRT的结合。这些细节未显示。
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