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.2017年4月14日；37（9）：e00558-16。
doi:10.1128/MCB.00558-16。 2017年5月1日印刷。

细胞粘附的关键调节因子：重要蛋白的鉴定和表征N个-整合素α5上用于细胞迁移的糖基化位点

青雷坑 1, Tomoya Isaji先生 1, 侯思聪 1, 王玉琴 1 2, 福田富美彦 1, 建国谷 三 2
附属公司

细胞粘附的关键调节因子：重要蛋白的鉴定和表征N个-整合素α5上用于细胞迁移的糖基化位点

庆蕾航等。 摩尔细胞生物学. .

摘要

这个N个-整合素α5β1的糖基化被认为控制着细胞行为的许多基本方面，包括细胞粘附和迁移。然而N个-聚糖的功能在很大程度上仍不清楚。这里，我们使用了一种功能损失方法。野生型（WT）整合素α5和N个-糖基化突变体S3-5（位点3-5）整合素α5，其含有较少的N个-聚糖在α5基因敲除的癌细胞中稳定重组。我们发现，与野生型相比，S3-5细胞的迁移能力降低。有趣的是，S3-5突变体中磷酸化的黏着斑激酶水平和肌动蛋白应激纤维的形成大大增强。在S3-5细胞中，活性整合素α5β1（而非总整合素）的内化以一种机制方式被抑制，这是一个与细胞表面活性整合素α5βl表达增强有关的过程。重要的是，恢复N个-α5β-螺旋桨结构域上的糖基化恢复了细胞迁移能力、活性α5β1的表达和内化。此外，这些N个-聚糖对α5-syndecan-4复合物的形成至关重要。这些发现表明N个-β-推进器结构域上的糖基化作用作为一个分子开关，控制细胞表面α5β1的动力学，而细胞迁移的最佳粘附需要α5β1。

关键词：N-聚糖；激活；复合地层；内部化。

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数字

图1
图1
用WT或S3-5突变体α5表达的细胞系中FN介导的细胞迁移的比较。（A） 电位示意图N个-WT和S3-5整合素α5亚基上的糖基化位点。假定N个-指出了糖基化位点（N84Q、N182Q、N297Q、N307Q、N316Q、N524Q、N530Q、N593Q、N609Q、N675Q、N712Q、N724Q、N773Q和N868Q）和点突变。TM，跨膜。（B和C）WT-和S3-5-MDA-MB-231细胞表现出相似的α5β1异二聚体形成能力（B）和细胞表面总整合素α5βl的表达水平（C）相同。（B，顶部）按照材料和方法中的描述建立稳定的细胞系。用抗GFP–琼脂糖免疫沉淀（IP）显示的细胞提取物，然后用抗β1和α5抗体进行Western blotting。（底部）全细胞提取物也进行了Western blotting（作为输入）。（C） 流式细胞术分析α5β1的表达水平。IgG用作对照。（D至G）GFP-、WT-和S3-5-MDA-MB-231细胞在FN上迁移的个体迁移轨迹、持续值和平均速度。（E） 通过延时视频显微镜观察指示细胞的运动(n个=12，来自三次重复实验）。（E到G）从轨迹图中提取偏移的方向性（E）、位移（F）和速度（G）。（H和I）通过伤口愈合和Transwell分析测定细胞伤口闭合（H）和向FN（I）迁移的能力。MDA-MB-231细胞的代表性图像显示在顶部。分别测量MDA-MB-231、HeLa和U-251MG细胞系相对于0 h的迁移距离（h）和迁移细胞数（I），并进行统计分析（底部，n个=3个单独实验）。所有值均以平均值±SE（误差条）的形式报告，由学生确定t吨测试。*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）< 0.001. 棒材，250μm（H）和350μm（I）。
图2
图2
S3-5细胞中细胞扩散、FAK磷酸化和肌动蛋白丝形成的变化。（A） 分离、阻断MDA-MB-231细胞，然后将其重新放置在FN涂层板上。培养20分钟后，固定细胞，并拍摄代表性图像。对圆形细胞和扩散细胞的百分比进行了统计分析（右）(n个=9，来自3个单独的实验）。（B） 分离MDA-MB-231细胞，将其悬浮在分析培养基中40分钟，然后将其重新放置在FN涂层板上指定的时间。用所示抗体进行免疫印迹。（C，左）在FN涂层培养皿上培养2天后，对所示MDA-MB-231和HeLa细胞进行裂解，并用所示抗体进行免疫印迹。（右）相对比率（p-FAK与FAK）(n个=3个单独实验）；S3-5突变细胞的相对比率为1.0。（D） GFP、WT和S3-5突变细胞中p-FAK（顶部）和肌动蛋白应激纤维（底部）的免疫荧光标记和共焦显微镜。将MDA-MB-231和HeLa细胞培养在FN涂层的盖玻片上，将细胞固定、渗透，然后分别用p-FAK和指骨苷-Alexa Fluor 549（actin）进行可视化。使用ImageJ软件定量p-FAK和指骨苷的相对荧光强度(n个=6，来自3个单独实验）；S3-5突变细胞的相对荧光强度为1.0。所有值均以平均值±SE（误差条）的形式报告，由学生确定t吨测试。n.s，不重要(P（P）> 0.05); *,P（P）< 0.05; ***,P（P）< 0.001. 棒材，120μm（A）和20μm（D）。
图3
图3
S3-5突变细胞中活性整合素β1的表达水平增加。（A和B）用流式细胞术（A）或生物素化（B）分析细胞表面（CS）或总细胞裂解物（TL）上活性和总整合素β1的表达水平，并用指示的抗体进行免疫印迹。底部显示了相对比率（活性β1与总β1）(n个=3个个体实验），S3-5突变细胞为1.0。（C） WT-和S3-5-MDA-MB-231细胞中活性整合素β1定位模式的比较。细胞在FN涂层盖玻片上培养，然后进行免疫染色分析。图像合并为总整合素β1（红色）和To-Pro-3染色（蓝色）。用ImageJ软件定量细胞表面总β1和活性β1的相对荧光强度(n个＝6，来自3个单独的实验）；S3-5突变细胞的相对荧光强度为1.0（底部）。所有值均以平均值±SE（误差条）的形式报告，由学生确定t吨测试。***，P（P）< 0.001. 棒材，20μm（C）。
图4
图4
S3-5突变MDA-MB-231细胞中活性整合素β1的延迟内化。（A） 对活性整合素β1、总整合素α5和总整合酶β1进行生化内化分析。在指定时间内，用亲和素-糖对指定的内化整合素进行免疫沉淀，然后进行Western印迹检测。将细胞裂解物用作对照，以显示WT和S3-5细胞之间所示整合素的类似表达水平。（B） 根据每个时间点MesNa抗性整合素的信号强度与对照组（不含MesNa）的值（即细胞表面的总整合素）相对应，统计计算内化整合素百分比(n个=3个单独实验）。（C） 如材料和方法中所述，使用涂有抗活性整合素β1、抗整合素α5或抗整合酶β1抗体的微量滴定孔，通过捕获ELISA测定内化期间WT和S3-5突变细胞内化整合素的比例。统计计算内化整合素的比例(n个=3个单独实验）。所有值均以平均值±SE（误差条）的形式报告，由学生确定t吨测试*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）< 0.001.
图5
图5
的重要性N个-α5β-螺旋桨结构域上的糖基化用于细胞迁移和α5-syndcan-4复合物的形成。（A） 电位示意图N个-WT和突变的α5亚基（S3-5；S1-9；S3-5,10-14；S1-5和S3-9）上的糖基化位点。（B） 恢复S1-9的WT细胞与突变细胞迁移能力的比较；S3-5,10-14；S1-5；或S3-9α5。按照材料和方法中的描述建立稳定的细胞系。分析了细胞迁移能力(n个=3个单独实验）。（C） 用流式细胞术分析活性β1和总β1的表达水平。（D） 通过捕获ELISA测定WT、S3-5、S1-5和S3-9突变细胞中活性整合素β1的内化。统计计算内化活性β1的比例(n个=3个单独实验）。（E，顶部）在FN涂层培养皿上培养2天后，对所示的MDA-MB-231细胞进行裂解，并用所示抗体进行免疫印迹。（底部）相对比率（p-FAK与FAK）(n个=3个单独实验）；S3-5突变细胞的相对比率为1.0。（F） 用流式细胞术分析WT和S3-5、S1-5和S3-9突变细胞上syndecan-4的表面表达水平。（G，顶部）用抗GFP–琼脂糖免疫沉淀MDA-MB-231细胞提取物，然后用抗syndecan-4（Syn-4）、活性β1、总β1和α5抗体进行Western blotting。（底部）还用指示的抗体对全细胞提取物进行免疫印迹。所有值均以平均值±SE（误差条）的形式报告，由学生确定t吨测试；*，P（P）< 0.05; ***,P（P）< 0.001. 棒材，350μm（B）。
图6
图6
整合素α5β1介导的细胞迁移调控的拟议模型N个-糖基化。（左）整合素α5β1可与多个受体（例如，syndecan-4）形成复合物，这可能触发活性α5βl内化和FA的转换，以提供适当的细胞基质粘附性，从而实现有效的细胞迁移。（右）然而，在缺乏α5突变体的情况下N个-在1号和2号位点糖基化后，细胞表面活性α5β1表达增加，与相关蛋白结合能力下降，细胞粘附信号增强，导致细胞迁移受到抑制。本研究为适度的细胞粘附最有利于细胞迁移的概念提供了新的见解（40）。实心箭头表示整合素α5β1介导的细胞迁移中的正常信号通路，而虚线箭头表示这些事件是异常的。
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