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.2016年11月17日：7:13498。
doi:10.1038/ncomms13498。

CUG-结合蛋白1调节HSC活化和肝纤维化

吴兴新 1, 吴旭东 1, 马玉祥 1, 邵芬丽 1, 杨坦 1, 谭涛 1, 顾丽云 1, 杨舟 1, 北城太阳 2, 杨孙 1, 吴雪峰 1, Qiang Xu（强旭） 1
附属公司

CUG-结合蛋白1调节HSC活化和肝纤维化

吴兴新等。 国家公社. .

摘要

肝星状细胞（HSC）的过度激活是肝纤维化的关键步骤。在这里，我们报道了CUG结合蛋白1（CUGBP1）在HSC中的表达升高，并且与人类肝活检中的肝纤维化严重程度呈正相关。转化生长因子β（TGF-β）以p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）依赖的方式选择性增加培养的HSC中CUGBP1的表达。敲除CUGBP1抑制体外HSC中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达并促进干扰素-γ（IFN-γ）的产生。我们进一步证明，CUGBP1特异性地结合到人类IFN-γmRNA的3'非翻译区（UTR）并促进其衰变。在小鼠中，CUGBP1的敲除减轻了胆管结扎（BDL）诱导的肝纤维化，而其过度表达加剧了肝纤维化。因此，CUGBP1介导的IFN-γmRNA衰减是促纤维化TGF-β依赖性激活HSC的关键事件，抑制CUGBP1-促进激活HSC中IFN-γ信号转导可能是治疗肝纤维化的新策略。

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数字

图1
图1。CUGBP1表达与肝纤维化分期相关。
(一)正常和肝纤维化活检中CUGBP1 mRNA的定量PCR分析(n个=30), ***P（P）<0.001（学生）t吨-测试。(b)组织阵列中CUGBP1、α-SMA和细胞球蛋白的天狼星红染色和IHF代表性切片（标尺，100μm，30个正常肝组织点和39个纤维化肝组织点）。箭头表示激活的HSC中CUGBP1（绿色）表达，α-SMA（红色）和细胞球蛋白（青色）均为阳性。(c（c）)CUGBP1 IHF评分与组织阵列Sirius红色染色切片Ishak纤维化分期评分的相关性分析。采用皮尔逊相关检验(P（P）显著性<0.05；第页=相关系数）。(d日,e（电子）)BDL小鼠非实质性肝细胞中CUGBP1表达的流式细胞术分析。（平均值±标准误差。；n个=3, *P（P）<0.05（学生）t吨-测试）。
图2
图2。TGF-β通过p38 MAPK增加HSC中CUGBP1的表达。
(一)人肝星状细胞系LX-2或人肝细胞L02细胞CUGBP1 mRNA定量PCR分析−1转化生长因子-β6小时（平均值±标准偏差。；n个＝3**P（P）<0.01（按学生）t吨-测试）。(b,c（c）)小鼠原代HSC LX-2细胞CUGBP1的Western blot分析(b)和原代小鼠肝细胞(c（c）)用或不用5 ng ml处理−1TGF-β持续24小时。数据代表三个独立实验（平均值±s.e.m。；n个=3, **P（P）<0.01学生t吨-测试）。(d日,e（电子）)用放线菌素D（1μg ml）处理LX-2细胞−1)并且有或没有5 ng ml−1指示时间间隔的TGF-β(d日). 用或不用SB431542（10μM）、SB203580（10μM）、SP600125（10μL）、FR180204（10μR）或SIS3（20μM）处理LX-2细胞，在5 ng ml−1TGF-β治疗6小时(e（电子）). 然后进行定量PCR检测CUGBP1的剩余mRNA表达。（平均值±标准误差。；n个=3, *P（P）<0.05, **P（P）经Dunnett检验后的单因素方差分析，<0.01）。(（f）)用5 ng ml SB431542处理或不处理LX-2细胞后的Western blot分析−1TGF-β治疗24小时(克)人类CUGBP1基因启动子和转录因子的Gene2promotor分析。(小时)将CUGBP1-CRE-Bio或mCUGBP1/CRE-Bio与LX-2细胞的总细胞提取物混合，进行探针下拉分析（f）使用SoftLink软释放亲和素树脂制备沉淀用于Western印迹。中的数据（f）和小时是两个独立实验的代表。
图3
图3。CUGBP1调节激活HSC中IFN-γ和α-SMA的表达。
(一)转染si-CUGBP1或对照siRNA 48小时的LX-2细胞CUGBP1的定量PCR分析(b,c（c）)用si-CUGBP1或对照siRNA转染LX-2细胞48小时后，用或不用5 ng ml−1TGF-β持续24 h。细胞提取物进行定量PCR分析（平均值±标准偏差。；n个=3) (b)和Western blot分析(c（c）). (d日)ELISA测定上清液IFN-γ（平均值±标准偏差。；n个=3). (e（电子）)用si-CUGBP1或对照siRNA转染48 h，然后用或不用5 ng ml处理的原代小鼠HSC中CUGBP1、α-SMA和IFN-γ的免疫荧光分析−1TGF-β持续24小时（比例尺，50μm）。这些数据代表了三个独立的实验**P（P）<0.01***P（P）<0.001学生t吨-测试。
图4
图4。CUGBP1通过减少IFN-γ的产生促进HSC活化。
(一)用si-CUGBP1或对照siRNA转染LX-2细胞48 h，然后用或不用TGF-β（5 ng ml）处理−1)对于所指示的时间间隔。然后对细胞提取物进行Western blot分析。(b)pY-STAT1和Smad7表达的折叠变化一. (c（c）)用si-CUGBP1或对照siRNA转染LX-2细胞48 h，然后用或不用TGF-β（5 ng ml）处理−1)或抗IFN-γ抗体（1μg ml−1)如24小时所示，对细胞提取物进行定量PCR分析（平均值±标准偏差。；n个=3). (d日)用si-CUGBP1或对照siRNA转染人纤维肉瘤2fTGH（亲代）细胞和U3A（STAT1-null 2fTGH）细胞60 h。对指示基因表达的定量PCR分析（平均值±标准差。；n个=3). 这些数据代表了三个独立的实验*P（P）<0.05, **P（P）<0.01（按学生）t吨-测试；NS，不显著。
图5
图5。CUGBP1通过与GRE序列结合诱导IFN-γmRNA衰减。
(一)IFN-γmRNA的3′-UTR装箱序列显示类似的GRE序列。IFN-γ-GRE-Bio和突变IFN-γ-GRE-Bio的序列用于结合反应。(b)mRNA下拉分析通过将IFN-γ-GRE-Bio或mIFN-γ/GRE-Bio与LX-2细胞的总细胞提取物混合进行。使用SoftLink软释放亲和素树脂制备沉淀用于Western印迹。(c（c）,d日)使用不同浓度的冷IFN-γ-GRE探针或mIFN-γ-GRE探针竞争IFN-γGRE-Bio与CUGBP1之间的结合。(e（电子）)实验如所示d日进行三次，并使用磷光成像仪定量结合带。(（f）)用si-CUGBP1或对照siRNA转染LX-2细胞48小时，并用放线菌素D处理指定时间。收集细胞进行定量PCR分析。
图6
图6。xinellone减轻BDL诱导的小鼠肝纤维化。
在8周龄C57BL/6小鼠中，通过使用不可吸收的细丝系紧总胆管进行BDL。BDL术后每天灌胃1次，共4周。小鼠随机分为5组(n个每组8个）：沙姆林、溴二苯醚、溴二苯醚+氟西汀10 mg/kg−1，溴化二苯醚+溴化二苯醚20 mg/kg−1和BDL+fraxinellone 40 mg kg−1. (一)肝组织的代表性照片，肝组织H&E染色、Masson染色和Sirius红色石蜡包埋切片的显微照片（比例尺，100μm）。(b)Masson染色切片的胶原评分。(c（c）)肝Hyp的表达水平。(d日)血清透明质酸、层粘连蛋白和III型前胶原的ELISA分析。(e（电子）)定量PCR分析小鼠肝脏中的α-SMA、α1（III）型胶原和α1（IV）型胶原。(b–e（电子），平均值±s.e.m。；n个=8). *P（P）<0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）通过Dunnett检验后的单向方差分析，与BDL相比<0.001，#P（P）<0.05，以及###P（P）<0.001与学生的虚假t吨-测试。
图7
图7。在BDL模型中，Fraxinellone调节TGF-β和IFN-γ信号传导。
(一)小鼠肝脏中α-SMA、CUGBP1、pSmad2、pSTAT1、Smad7和α-微管蛋白表达的Western blot分析。(b)肝脏冷冻切片中α-SMA和CUGBP1表达的IHF分析（比例尺，100μm）。(c（c）)肝脏冷冻切片中IFN-γ表达的IHF分析（比例尺，50μm）。箭头表示HSC中的IFN-γ（绿色），α-SMA（红色）和Reelin（青色）均为阳性。
图8
图8。HSC中的CUGBP1促进BDL诱导的小鼠肝纤维化。
在BDL手术前，小鼠静脉注射AAV 8周。xinellone 40毫克千克−1BDL术后每天灌胃一次，共4周。VA-Lip-siRNA-CUGBP1（0.75毫克千克−1)BDL术后每周静脉注射3次，共4周。(一,d日)肝组织H&E染色、Masson染色和Sirius红色染色石蜡包埋切片的代表性显微照片（比例尺，100μm）。(b,e（电子）)天狼星红染色切片的Ishak纤维化分期评分。(c（c）,（f）)肝Hyp的表达水平。(b,c（c）,e（电子）,（f），平均值±标准误差。；n个=6). *P（P）<0.05，以及**P（P）<0.01，如学生所示t吨测试；NS，不显著。
图9
图9。CUGBP1调节BDL小鼠HSC中α-SMA和IFN-γ的表达。
(一)上述处理的小鼠肝脏冷冻切片中α-SMA和CUGBP1表达的IHF分析。（比例尺，100μm）。(b)如上所述处理的小鼠非实质肝细胞中IFN-γ表达的流式细胞术分析。（平均值±标准误差。；n个=3). **P（P）<0.01，如学生所示t吨-测试；NS，不显著。
图10
图10。CUGBP1调节HSC中TGF-β和IFN-γ信号通路。
CUGBP1介导HSC激活中TGF-β和IFN-γ信号通路之间的失调，可用于药物靶向。TGF-β/p38 MAPK/ATF2信号在HSC中诱导CUGBP1表达。增加的CUGBP1与IFN-γmRNA的3′-UTR的GRE序列结合，并促进激活HSC中IFN-γm RNA的降解。在fraxinellone治疗中降低CUGBP1诱导IFN-γ/STAT1信号的激活，从而限制HSC中TGF-β信号的传递。
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