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.2016年2月；8(2):328-44.
doi:10.18632/aging.100897。

NKG2D配体介导衰老细胞的免疫监视

阿迪·萨吉夫 1, 多米尼克·G·A·伯顿 1 2, 扎纳·莫沙耶夫 1, 埃兹拉·瓦代 1, 费利克斯·温斯文 三, 希夫拉·本多尔 4, 奥夫拉·戈拉尼 5, 博扬警察局 三, 瓦列里·克里扎诺夫斯基 1
附属公司

NKG2D配体介导衰老细胞的免疫监测

阿迪·萨吉夫等。 老龄化（纽约奥尔巴尼）. 2016年2月.

摘要

细胞衰老是一种限制肿瘤发生和组织损伤的应激反应机制。细胞衰老的诱导通常与免疫原性表型一致，该表型促进免疫系统成分的自我抑制，从而促进肿瘤抑制和限制伤口修复过程中的过度纤维化。衰老细胞调节其免疫监视的机制尚不完全清楚。在这里，我们发现激活的自然杀伤细胞受体（NKG2D）、MICA和ULBP2的配体在诱导复制性衰老、肿瘤诱导衰老和DNA损伤诱导衰老后持续上调。MICA和ULBP2蛋白对于NK介导的对衰老成纤维细胞的有效细胞毒性是必要的。衰老细胞中NKG2D配体初始表达的调节机制依赖于DNA损伤反应，而这些配体的持续表达受ERK信号通路的调节。在肝纤维化中，缺乏NKG2D受体的小鼠中衰老活化星状细胞的积累增加，导致纤维化加剧。总的来说，我们的研究结果为衰老细胞中免疫配体表达的调节机制提供了新的见解，并揭示了NKG2D受体-配体相互作用在预防肝纤维化中的重要性。

关键词：DNA损伤反应；ERK；NKG2D；自然杀伤细胞；纤维化；衰老。

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数字

图1
图1。衰老细胞上调NKG2D配体
RT-PCR分析表明MICA、ULBP1和ULBP2在DNA损伤诱导衰老（DIS）中持续上调(A类)，复制衰老（RS）(B)和H-RAS第12版-介导致癌诱导衰老（OIS）(C)与生长中的（对照）细胞相比，IMR-90成纤维细胞。同样，DIS WI38(D类)和BJ(E类)成纤维细胞和DIS肝星状细胞(F类)也显示NKG2D配体上调。这些图表表示至少四个独立实验中至少三次测量的平均值和S.E.M。双尾t检验*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001。
图2
图2。衰老细胞上调细胞表面的MICA和ULBP2
(A类)ImageStream分析表明，与对照（生长）细胞相比，DIS IMR-90成纤维细胞（衰老）的细胞表面膜上MICA和ULBP2的表达水平更高。(B)总强度和总膜强度的量化表明DIS IMR-90细胞中的MICA和ULBP2水平高于生长（对照）细胞。(C)在非渗透性细胞上进行的MICA和ULBP2的代表性免疫荧光染色表明，与生长（对照）细胞相比，DIS WI38和BJ细胞的细胞表面膜上这些蛋白的表达水平更高。比例尺：50μm。MICA和ULBP2显示为红色。DAPI显示为蓝色。数据以三个独立实验的S.E.M平均值表示。双尾t检验*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001。
图3
图3。NKG2D受体-配体相互作用介导NK细胞对衰老细胞的识别
生长和衰老（DIS）IMR-90成纤维细胞与NK92共同培养(A类)或原代NK细胞(B)在存在不同阻断抗体的情况下，2小时后评估对衰老细胞的细胞毒性百分比。(C,D类)使用特异性siRNA敲除MICA和ULBP2，并通过定量RT-PCR评估敲除效率。(E类)在衰老或生长（对照）细胞中敲低MICA和ULBP2后，评估NK92细胞对衰老细胞的细胞毒性程度。数据以三个独立实验的S.E.M平均值表示*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001。
图4
图4。衰老细胞中MICA和ULBP2的表达稳定上调，而非静止细胞
用足叶乙甙（100μM）处理生长中的IMR-90、WI38和BJ细胞，并通过RT-PCR评估MICA和ULBP2的表达水平。MICA的表达(A类)和ULBP2(B)在治疗24小时后升高，并在整个指定时间点保持在较高水平。第0天的生长细胞作为对照。(C)用低浓度足叶乙甙（10μM）处理生长细胞以诱导短暂生长停滞，并通过RT-PCR评估MICA和ULBP2的表达水平。(D类)IMR-90细胞生长汇合，并继续维持7天，直到细胞静止。与生长和衰老细胞相比，通过RT-PCR评估，静止诱导的细胞周期阻滞不足以提高MICA和ULBP2的表达。数据以三个独立实验的S.E.M平均值表示。双尾t检验*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001。
图5
图5。DDR对MICA和ULBP2表达的贡献
(A类,B)生长细胞在依托泊苷治疗（100μM）前用ATM抑制剂KU60019（10μM，A）或ATM/ATR抑制剂咖啡因（5mM，B）治疗1小时。24小时后，通过RT-PCR评估MICA和ULBP2的表达水平。(C,D类)用KU60019（10μM）处理DIS IMR-90细胞24、48、72和96小时，并检测MICA的表达(C)和ULBP2(D类)在每个时间点通过RT-PCR进行评估。数据以三个独立实验的S.E.M平均值表示。双尾t检验*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001。
图6
图6。ERK活性调节DIS细胞中MICA和ULBP2的表达
对DIS IMR-90细胞和生长细胞的裂解物进行Western blot分析，以评估衰老细胞中ERK1/2的磷酸化，并评估PD184352（10μM，48小时）对ERK1/2磷酸化的影响(A类). 作为对照，评估ERK和微管蛋白的总表达。(B,C)在DIS上抑制ERK活性48小时后，测定MICA和ULBP2的表达水平(B)和OIS(C)单元格。另外两种MEK抑制剂（AZD6244和GSK1120212）也降低了ERK1/2磷酸化(D类和E类)通过RT-PCR评估，在指定的潜伏期内显著降低MICA和ULBP2的表达(F类和G公司). 通过RT-PCR评估，PD184352还显著降低了指示细胞因子的表达(H（H）). 数据以三个独立实验的S.E.M平均值表示。双尾t检验*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001。
图7
图7。NKG2D受体促进衰老细胞清除并限制肝纤维化体内
Nkg2d号击倒（Nkg2d−/−)和WT小鼠用CCl处理4诱导纤维化。(A类)肝脏切片进行H&E和天狼星红染色。比例尺：100μm。(B)纤维化区域的量化显示Nkg2千克−/−CCl后肝脏与WT的比较4治疗。(C)αSMA是活化HSC的标志物，其表达通过全肝提取物的Western blot分析和(D类)定量RT-PCR。每个基因型有四只小鼠(C). (E类)SA-β-gal染色确定WT和Nkg2d号−/−老鼠。比例尺：100μm。(F类)WT和WT肝脏SA-β-gal染色的定量Nkg2d号−/−老鼠。每种基因型至少有6只小鼠用于定量分析B和F类; 双尾t检验*P（P）<0.05, ***P（P）<0.0001.
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