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.2015年12月4日；290(49):29345-60.
doi:10.1074/jbc。M115.682229。 Epub 2015年10月19日。

整合素α5通过N-糖基化抑制表皮生长因子受体磷酸化及其细胞增殖信号

青雷坑 1, Tomoya Isaji先生 1, 侯思聪 1, Sanghun我 1, 福田富美彦 1, 建国谷 2
附属公司

整合素α5通过N-糖基化抑制表皮生长因子受体的磷酸化及其细胞增殖信号传导

青雷坑等。 生物化学杂志. .

摘要

整合素α5β1介导的细胞粘附调节多种细胞反应，包括细胞增殖、存活和不同细胞信号通路之间的串扰。已知整合素α5β1可传递允许信号，使锚定依赖性受体酪氨酸激酶信号传导。然而，整合素α5β1对细胞增殖的影响存在争议，整合蛋白α5βl与受体酪氨酸激酶之间调节的分子机制仍不清楚。在这里，我们表明整合素α5通过其N-糖基化作用作为表皮生长因子受体（EGFR）信号的负调控因子。WT整合素α5的表达抑制EGF刺激时EGFR的磷酸化和内化。然而，含有较少N-聚糖的N-糖基化突变体整合素α5、S3-5的表达逆转了EGFR-介导的信号传导和细胞增殖的抑制。以机械方式，WT而非S3-5整合素α5在低密度脂筏中与EGFR和糖脂形成复合物，复合物的形成在EGF刺激下被破坏，表明整合素β5的N-糖基化通过促进整合素γ5-糖脂-EGFR复合物的生成抑制EGFR的激活。此外，在整合素α5的Calf-1,2结构域上持续恢复这些N-聚糖，恢复了抑制作用以及与EGFR的复合物形成。综上所述，这些数据首次证明了EGFR激活可以通过整合素α5的N-糖基化进行调节，这是整合素与生长因子受体之间相互作用的一种新的分子范式。

关键词：细胞生长；表皮生长因子受体；糖生物学；糖基化；整合素；脂筏；发送信号。

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数字

图1。
图1。
野生型和S3–5突变体α5亚基表达对CHO细胞生长的影响。 A类，电位示意图N个-WT和S3–5整合素α5亚基上的糖基化位点。假定N个-糖基化位点（N84Q、N182Q、N297Q、N307Q、N316Q、N524Q、N530Q、N593Q、N609Q、N675Q、N712Q、N724Q、N773Q和N868Q）表示为三角形，点突变表示为十字架。B类对照组、GFP、WT和S3-5细胞的EGFR和整合素α5β1表达水平相同。按照“实验程序”一节所述建立稳定的细胞系。流式细胞术分析细胞表面和总细胞裂解物中整合素α5β1和EGFR的表达水平(左边)或生物素化(右上角)和带有指示抗体的WB(右下角)分别是。IgG和α-微管蛋白作为对照。C类，WT而不是S3–5转染子表现出细胞生长下降。饥饿24小时后，向细胞供应含有10%FBS的DMEM，然后在指定时间对细胞数量进行计数和统计分析(n个=3个单独实验）。D类，WT细胞的集落形成能力受到抑制，但S3–5细胞不受抑制。细胞集落的图像显示在左边在塑料盘上播种14天后，菌落被结晶紫染色。这个外径595GFP、WT和S3–5组的值与对照组的值进行了标准化(n个=3个单独实验）。电子，WT而非S3–5细胞的致瘤性下降体内.指示的单元格（1×106)在左侧腹部皮下注射。肿瘤被解剖，其体积(左边)和重量(正确的)21天后发现(n个= 4). 所有值均为平均值±S.E(误差线)，学生的t吨测试；n.s，不重要(第页> 0.05); **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001.比例尺，1厘米(D类).
图2。
图2。
WT而非S3–5整合素α5的表达抑制EGFR-介导的细胞信号传导。 A类，EGFR相关的细胞信号传导在WT细胞中受到抑制。将来自所示细胞的细胞裂解液与带有所示抗体的WB进行接触(左边). 相对比率（磷酸-EGFR、磷酸-ERK和磷酸-AKT与EGFR、ERK和AKT）分别显示在正确的(n个=3个单独实验）。B类，野生型、S3–5和对照细胞在EGF刺激下的细胞生长比较。饥饿后，向细胞提供含有或不含EGF（0.1 ng/ml）的完整培养基。在指定时间统计细胞数量并进行统计分析(n个=3个单独实验）。C类WTα5的表达降低了EGF的反应。饥饿24小时后，用指示浓度的EGF处理细胞5分钟。用指示的抗体进行WB分析。D类和电子，抗EGFR-blocking抗体治疗对EGFR-related cell signaling的影响(D类)和细胞生长(电子)在正常培养条件下（无EGF刺激）。细胞在含有10μg/ml IgG（对照）或抗EGFR阻断Ab的完整培养基中培养72小时，所得细胞提取物用所示抗体进行WB(抗体) (D类)，并对细胞数进行统计和统计分析(n个=3个单独实验）(电子)分别是。所有值均为平均值±S.E(误差线)，学生的t吨测试；*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001.
图3。
图3。
整合素α5的表达抑制HeLa细胞的细胞生长和EGFR细胞信号传导。 A类和B类流式细胞术分析评估了使用CRISP/Cas9系统敲除α5基因的效率(A类)和WB(B类). 整合素α5-KO HeLa细胞按照“实验程序”中的描述建立C类α5 KO-HeLa细胞的生长能力增强。如图1图例所示，对细胞生长进行分析C类(n个=3个单独实验）。D类流式细胞术分析α5 KO-HeLa细胞中具有WT和α5突变体S3–5的复苏细胞，评估细胞表面整合素α5β1和EGFR的表达水平。电子，比较这些转染剂的细胞生长。如上所述，对KO、GFP、WT和S3–5 HeLa细胞生长进行分析(n个=3个单独实验）。F类与其他细胞相比，WT细胞中EGFR和ERK的磷酸化水平受到显著抑制。左侧、WB模式；正确的，定量分析(n个＝3个单独的实验）。克，WT细胞在EGF刺激下也表现出减弱的EGFR反应。WB对EGF指示浓度的响应如图2所示C类所有数值均为平均值±S.E(误差线)，学生的t吨测试；**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001.
图4。
图4。
整合素α5的表达也抑制U-251MG和MDA-MB-231细胞的细胞生长和EGFR细胞信号传导。按照“实验程序”所述建立相关整合素α5-KO细胞。通过流式细胞术分析评估建立的α5-KOU-251MG和MDA-MB-231细胞(A类)和WB(B类).C类流式细胞术检测相关整合素α5拯救的U-251MG和MDA-MB-231细胞中整合素a 5β1和EGFR的表达水平。IgG和α-微管蛋白作为对照。D–I这些用WT（而不是S3–5）挽救的细胞也表现出生长迟缓、EGFR信号减少和EGF反应减弱。这些现象与在HeLa细胞中观察到的现象相似，如图3所示。所有值均为平均值±S.E(误差线)，学生的t吨测试；*，第页< 0.05; **,第页< 0.01 (n个=3个单独实验）。
图5。
图5。
整合素α5减少了EGF刺激CHO-B2细胞时EGFR的内化。 A类与其他细胞相比，WT细胞中EGFR的内化受到抑制。如“实验程序”所述，进行EGFR的生化内化分析。在指定时间内化的EGFRs通过亲和糖免疫沉淀，然后进行WB检测EGFR。细胞裂解物用作对照，以显示这些细胞中EGFR的类似表达水平。B类，对EGFR内化率进行统计分析(正确的;n个=3个单独实验）。C类EGF刺激后，WT细胞中的EGFR内吞受到抑制，但S3–5细胞中的内吞没有受到抑制。图示为50 ng/ml EGF-555在指定时间治疗后EGFR内吞的典型图像。图像与EGF-555和TO-PRO-3染色合并。D类，量化随机场中内化EGF-555点/细胞的数量(n个=9，来自三次重复实验）。所有值均为平均值±S.E(误差线)，学生的t吨测试；*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001.比例尺，10微米(C类).
图6。
图6。
整合素α5与EGFR相关并调节EGFR在脂筏中的定位。 A类与WT细胞相比，S3–5细胞中整合素α5与EGFR的结合减少。所示CHO-B2细胞提取物经免疫沉淀(IP（IP）)含抗GFP琼脂糖(左侧面板)或抗EGFR抗体(右侧面板)，然后进行WB，依次进行抗EGFR和整合素α5抗体的检测。B类在HeLa、U-251MG和MDA-MB-231S3-5突变细胞中，整合素α5和EGFR之间的相互作用也降低。所示细胞提取物按照A类粗细胞提取物也使用所示抗体进行WB作为“输入”(底部面板).C类EGF刺激后，整合素α5与EGFR的相互作用减弱。将显示的CHO-B2细胞培养在涂有或不涂有10μg/ml FN的培养皿上24小时，然后用或不涂EGF以0.1 ng/ml的浓度刺激5分钟。所得细胞裂解物（作为输入；底部面板)用抗EGFR和整合素α5抗体直接印迹或用抗GFP琼脂糖免疫沉淀(顶部面板)然后用抗EGFR抗体进行印迹。D类比较EGFR和整合素α5在指示的CHO-B2低密度脂筏中的定位。整合素α5和EGFR从所示细胞裂解物中分配到脂筏组分中，如“实验程序”所述。组分1是梯度的顶部，组分12是底部。整合素α5和EGFR的定位位移用灰色虚线.Caveolin-1(洞穴-1)用作脂筏的标记。电子，EGFR和整合素α5的复合物由GM1介导。使用或不使用甲基-β-环糊精预处理所示CHO-B2细胞(M（M）-β-CD光盘)（10米米)治疗后，细胞裂解物与生物素化霍乱毒素B亚单位孵育1小时(CTB（全面禁试条约）)再培养1h，然后用亲和素-海藻糖珠免疫沉淀。免疫沉淀物用抗EGFR和整合素α5抗体进行WB检测(顶部面板). 整个细胞裂解物也受到带有所示抗体的WB的影响(底部面板; 作为输入）。
图7。
图7。
N个-整合素α5 Calf-1,2结构域上的糖基化介导其生长抑制功能。 A类，电位示意图N个-糖基化突变整合素α5亚单位（WT、S3-5、Δ10-14和S3-5,10-14）。B类与WT细胞相比，整合素α5突变细胞在细胞表面表达的α5β1和EGFR水平相同。按照“实验程序”所述建立稳定的挽救CHO-B2细胞系（10–14和S3–5，10–14）。通过流式细胞术分析细胞表面α5β1和EGFR的表达水平。IgG用作对照。C类α5突变体细胞的细胞扩散能力与WT细胞相当。将细胞分离，然后重新种植在FN包被的培养皿上。培养20分钟后，固定细胞并拍摄图像。对圆形细胞、扩散细胞和细长细胞的百分比进行了统计分析(底部面板,n个=9，来自三次重复实验）。D类与WT细胞相比，S3–5,10–14细胞对细胞生长的抑制能力相似，而不是10–14细胞。如图1图例所示，分析了WT、S3–5、10–14和S3–5,10–14的细胞生长能力C类(n个=3个单独实验）。电子EGFR相关的细胞信号在S3–5,10–14细胞中恢复。将来自所示细胞的细胞裂解液与所示抗体进行WB(左边). 对相对比率进行了统计分析(正确的,n个=3个单独实验）。F类S3–5,10–14细胞对EGF的反应降低。将细胞缺血24小时，然后用指示浓度的EGF处理5分钟，然后用指定抗体对所得细胞提取物进行WB分析。克整合素α5和EGFR之间的相互作用也在S3–5,10–14细胞中被挽救。用抗GFP琼脂糖免疫沉淀指示的细胞提取物，然后用抗EGFR和WBα5抗体免疫沉淀(顶部面板). 使用所示抗体对整个细胞提取物进行WB(底部面板; 作为输入）。H（H）EGFR和整合素α5在低密度脂筏中的定位也在S3–5,10–14细胞中恢复。如图6图例所示，检测到整合素α5和EGFR在脂筏组分中的分布D类整合素α5和EGFR的定位位移用灰色虚线小窝蛋白-1(洞穴-1)用作脂筏的阳性对照。所有值均为平均值±S.E(误差线)，学生的t吨测试；**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001.比例尺，120微米。
图8。
图8。
EGFR细胞信号调控的拟议分子机制N个-整合素α5的糖基化。在整合素α5中N个-其Calf结构域细胞的糖基化(左边)整合素α5β1与EGFR以及脂筏中的鞘糖脂形成复合物，可能限制EGFR内化和EGF刺激时的相关信号传导，从而抑制细胞增殖。然而，在整合素α5缺乏或突变（缺失N个-小腿结构域细胞上的糖基化(正确的)，大多数EGFR位于脂筏中，不含整合素α5，导致EGFR在EGF刺激后迅速活化和内化。这个粗箭头线表明EGF反应迅速，信号转导强，而较细的箭头线表示这些事件被禁止。
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