Endofin, a novel BMP-SMAD regulator of the iron-regulatory hormone, hepcidin

doi:10.1038/srep13986

.2015年9月11日5:13986。

doi:10.1038/srep13986。

Endofin，铁调节激素hepcidin的一种新型BMP-SMAD调节剂

贾斯汀·B·高^1 2, 丹尼尔·华莱士^1 2, Wanjin Hong公司^三, V内森·苏布拉曼尼亚^1 2

附属公司

¹澳大利亚布里斯班QIMR Berghofer医学研究所。
²昆士兰大学医学和生物医学学院，澳大利亚布里斯班。
^三新加坡分子与细胞生物学研究所。

PMID： 26358513
预防性维修识别码：项目经理4566084
内政部： 10.1038/代表13986

Endofin，铁调节激素hepcidin的一种新型BMP-SMAD调节剂

贾斯汀·B·高等。科学代表. 2015.

.2015年9月11日5:13986。

doi:10.1038/srep13986。

作者

贾斯汀·B·高^1 2, 丹尼尔·华莱士^1 2, 万金红^三, V内森·苏布拉曼尼亚^1 2

附属公司

¹澳大利亚布里斯班QIMR Berghofer医学研究所。
²澳大利亚布里斯班昆士兰大学医学和生物医学科学学院。
^三新加坡分子与细胞生物学研究所。

PMID： 26358513
预防性维修识别码：项目经理4566084
内政部： 10.1038/代表13986

摘要

BMP-SMAD信号在许多生物过程中起着关键作用，包括胚胎发育和铁稳态。铁调节激素hepcidin的失调与许多临床铁相关疾病有关。我们假设，介导BMP-SMAD信号的分子在调节铁稳态中发挥重要作用，这些蛋白中的变体可能是铁相关疾病的潜在遗传修饰物。我们检测了内切芬（SMAD锚定物）的作用，发现肝细胞内切芬的敲低抑制了基础和BMP诱导的hepcidin以及其他BMP调节基因ID1和SMAD7的表达。我们首次显示了内切芬与SMAD蛋白的原位相互作用，并通过内切芬敲除显著降低了SMAD磷酸化，表明内切芬通过BMP-SMAD信号调节庚肽。自然发生SNP的特征表明，保守FYVE结构域中的突变会导致内切芬的定位错误，可能会影响下游信号传递和调节hepcidin的表达。总之，我们已经确定了BMP-SMAD信号通路与hepcidin表达调控和铁稳态之间迄今尚未认识到的联系，即内切酶。这项研究进一步定义了铁调节的分子网络，并为铁相关疾病的治疗提供了潜在的靶点。

PubMed免责声明

数字

**图1。内皮素沉默与基础庚肽表达减少相关。**
HepG2/C3A细胞用非特异性siRNA（si-NS，白色条）或内鳍siRNA（si-endofin，黑色条）转染24-96小时(一)*ZFYVE16型*（内啡肽）(b条)*HAMP公司*, (**c（c）**)*标识1*和(d日)*SMAD7系列*通过qPCR测量并归一化为参考基因的几何平均值*ACTB公司*和*高功率晶体管*数据代表三个独立的生物实验。条形图表示三元组的平均值±标准误差。*P（P）*-使用双向方差分析计算相对于si-NS对照组的内切酶敲除值*表示第页-值<0.05**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001.

**图2。BMP诱导的*HAMP公司*,*标识1*和*SMAD7系列*内脏击倒后水平降低。**
C3A细胞转染非特异性siRNA（si-NS，白条）或内切酶siRNA（si-*内啡肽*（黑色条）72小时，用BMP6以1、10或100 ng/ml的剂量处理4小时(一)*ZFYVE16型*（内啡肽）(b条)*HAMP公司*, (**c（c）**)*标识1*和(d日)*SMAD7系列*通过qPCR测量并归一化为参考基因的几何平均值*ACTB公司*和*高功率晶体管*数据代表三个独立的生物实验。条形图表示三倍的平均值±标准误差。*P（P）*-使用双向方差分析计算数值*表示第页-值<0.05**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001.

**图3。近端连接实验表明，内脏而非SARA与SMAD1相互作用。**
在用myc、SMAD1和SMAD2/3总抗体处理PLA之前，用myc标记的内切酶或myc标记SARA质粒转染C3A细胞48小时。作为阴性对照，C3A细胞与一种抗体孵育（顶面板），对于阳性对照，我们使用形成同源二聚体的内源性TfR1。剩下的面板显示了用两种抗体培养的细胞，以评估SMAD锚定和SMAD蛋白的相互作用。PLA实验后，将细胞与抗小鼠第二抗体孵育，以鉴定转染的细胞（左图）。中间面板显示PLA对SMAD锚定和SMAD相互作用的评估，右侧面板显示融合的免疫荧光（IF）和PLA图像。细胞核用DAPI染色，如中间和右侧面板所示。数据代表了三个独立的生物实验。比例尺代表20μm。

**图4。内膜沉默减少SMAD1/5/8蛋白的磷酸化。**
在用BMP6（10 ng/ml）处理4小时之前，用非特异性siRNA（si-NS）或内切酶特异性siRNA（si-endofin）转染C3A细胞72小时(一)收集细胞，用抗内切芬、磷酸-SMAD1/5/8抗体对裂解产物进行免疫印迹。β-actin作为负荷对照。扫描胶片上显影的色带，用密度测定法定量内脏的含量(b条)和pSMAD1/5/8蛋白(**c（c）**)使用GeneGenius成像系统相对于肌动蛋白。mRNA表达(d日)*ZFYVE公司*（内啡肽）(**e（电子）**)*HAMP公司*, (**（f）**)*标识1*和(克)*SMAD7系列*通过qPCR测量并归一化为参考基因的几何平均值*ACTB公司*和*高功率晶体管*数据代表三个独立的生物实验。条形图表示三倍的平均值±标准误差。*P（P）*-使用双向方差分析计算相对于si-NS对照组的内切酶敲除值*表示p值<0.05**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001.

**图5。破坏内脏保守FYVE结构域的突变会导致定位错误。**
通过定点突变产生含有六个经鉴定为潜在有害的天然内啡肽的质粒构建物，并转染到C3A细胞中。48小时后，用抗HA抗体对细胞进行免疫染色（第一列）。细胞也用细胞器标记物EEA1和ERp57进行免疫染色，如第二列所示。细胞核用DAPI染色，如第三列所示，第三列是第一和第二面板的覆盖层。(一)FYVE域（红色矩形）的内脏蛋白结构示意图，并绘制了非同义（方框）和移码（三角形）突变。(b条)Western blotting显示了含有非同义和移码SNP的蛋白质的相应大小以及提前终止密码子。(**c（c）**)面板显示，C3A细胞转染了不受FYVE结构域影响的内脏SNP变体。(d日)面板显示转染SNP变体的C3A细胞影响FYVE域。数据代表了三个独立的生物实验。比例尺代表20μm。

**图6。内酯通过BMP-SMAD途径调节庚啶的示意图。**
在BMP配体结合后，II型受体在甘氨酸-氨基酸结构域磷酸化I型受体，导致其活化，R-SMAD磷酸化，SMAD1/5/8，随后与SMAD4形成杂合物，然后转移到细胞核以激活庚啶的转录。Endofin将SMAD招募到BMP受体，调节SMAD1/5/8磷酸化，从而调节hepcidin的表达。

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