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.2015年2月26日4:4:e05033。
doi:10.7554/eLife.05033。

小分子ISRIB逆转eIF2α磷酸化对翻译和应激颗粒组装的影响

卡梅拉·西德劳斯基 1, 安娜·麦盖希 2, 尼古拉斯·T·英格里亚 2, 彼得·沃尔特 1
附属公司

小分子ISRIB逆转eIF2α磷酸化对翻译和应激颗粒组装的影响

卡梅拉·西德劳斯基等人。 埃利夫. .

摘要

此前，我们将ISRIB确定为综合应激反应（ISR）的有效抑制剂，并表明ISRIB使细胞对eIF2α磷酸化的影响产生抵抗，并增强啮齿动物的长期记忆（Sidrauski等人，2013）。在这里，我们通过全基因组体内核糖体分析表明，限制性mRNA亚群的翻译是在ISR激活时诱导的。ISRIB实质性地逆转了eIF2α磷酸化引起的翻译效应，并且在非应激细胞中未诱导翻译或mRNA水平的重大变化。eIF2α磷酸化诱导的应激颗粒（SG）的形成被ISRIB阻断。令人惊讶的是，ISRIB添加到带有预先形成的SG的应激细胞中，诱导其快速分解，将mRNA释放到活性翻译池中。恢复mRNA翻译和调节SG动力学可能是一种有效的治疗以eIF2α磷酸化、SG形成和认知丧失为特征的神经退行性疾病的方法。

关键词：ISRIB；细胞生物学；eIF2；人；综合应激反应；小鼠；神经科学；蛋白质合成；核糖体分析；未展开的蛋白质反应。

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提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1。
图1哺乳动物细胞内质网应激的翻译调控。
(A类)内质网应激后HEK293T细胞的翻译和mRNA变化。用或不用1μg/ml的Tm处理HEK293T细胞1小时。y轴表示经Tm处理的样品和对照样品之间核糖体保护片段（Ribo-Seq）的倍数变化。x轴表示Tm处理样品和对照样品之间mRNA水平（mRNA-Seq）的折叠变化。反映Tm处理和未处理（“UT”）样品之间显著变化（FDR校正p值<0.1）的数据点以黑色显示，非显著变化以浅灰色显示。请注意，Tm处理的细胞中有大量发生显著变化的基因（黑圈），因此没有发生显著变化（灰圈）的基因云大多隐藏在背景中。已知RFP和uORF显著增强且受磷酸化eIF2α依赖性调节的基因标记为粉红色。包含先前识别的uORF的ISR转换目标标记为绿色。三角形表示超出轴范围的基因。灰色框中的基因是那些RPF或mRNA读数变化不到两倍的基因。图1——源数据2A包含了在Tm诱导期间RPF中变化两倍以上的所有基因的列表（FDR校正的p值<0.1，对应于方框上方和下方的黑色圆圈）。(B类)用Tm和ISRIB联合处理的细胞中的翻译和mRNA变化。用或不用1μg/ml的Tm和200 nM的ISRIB处理HEK293T细胞1小时。y轴表示Tm+ISRIB治疗样品和对照样品之间核糖体保护片段（Ribo-Seq）的倍数变化。x轴表示Tm+ISRIB处理样品和对照样品之间mRNA水平（mRNA-Seq）的折叠变化。当ISRIB联合用药调节Tm治疗效果时，显著改变的基因以黑色显示（FDR校正的p值<0.1）。图1——源数据2C包含了在Tm和ISRIB治疗期间RPF中发生两倍以上变化的所有基因列表（FDR校正的p值<0.1）。包含先前识别的uORF（标记为绿色）的ISR-翻译目标的身份未包含在此面板中，因为它们都折叠到图的中心。(C类)ISRIB处理细胞的翻译和mRNA变化。使用或不使用200 nM ISRIB处理HEK293T细胞1小时。y轴表示ISRIB治疗和对照样品之间核糖体保护片段（Ribo-Seq）的折叠变化。x轴表示ISRIB处理样品和对照样品之间mRNA水平（mRNA-Seq）的折叠变化。ISRIB-处理和未处理（“UT”）样品之间反映显著变化（FDR-校正p值<0.1）的数据点以黑色显示，非显著变化以浅灰色显示。图1——源数据2D包含在ISRIB治疗期间RPF中发生两倍以上变化的所有基因列表（FDR校正的p值<0.1，对应框外的黑色圆圈）。添加ISRIB后，ATF4和SLC35A4（在该面板中标记）显示翻译效率降低。每个条件分析两个生物复制。图1源数据2E中显示了与所有样本的基因组和ORF对齐的读取数。图1-图补遗3中给出了每种情况下重复试验的相关图。图1补充图4中显示了所有绘制的ORF的mRNA丰度。图1源数据1中显示了所有条件和每个单独转录本的读取计数。Ribo-seq和mRNA-seq数据已保存在NCBI的基因表达总览中，可通过GEO系列登录号GSE65778访问。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.05033.002
图1——图补充1。
图1补充图1。ATF4和SLC35A4 5'UTR的核糖体和mRNA密度。
mRNA读取（y轴）沿上部面板中每个基因的序列（x轴）表示。核糖体足迹（核糖）读数（y轴）沿下方面板中每个基因的序列（x轴）表示。已知和预测的uORF沿序列显示为绿色。ORF沿着序列以蓝色表示。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.05033.005
图1—图补充2。
图1-图补充2。电流应力下mTOR靶的平移调节。
(A类)用或不用1μg/ml的Tm处理细胞1小时。y轴表示经Tm处理的样品和对照样品之间核糖体保护片段（Ribo-Seq）的折叠变化。x轴表示Tm处理样品和对照样品之间mRNA水平（mRNA-Seq）的折叠变化。仅绘制mTOR平移目标（颜色为浅绿色）。Tm-治疗和未治疗（UT）之间mTOR基因的显著变化（FDR-校正p值<0.1）以黑色突出显示。(B类)使用或不使用1μg/ml的Tm和200 nM的ISRIB处理细胞1小时。y轴表示Tm+ISRIB治疗样品和对照样品之间核糖体保护片段（Ribo-Seq）的倍数变化。x轴表示Tm+ISRIB处理样品和对照样品之间mRNA水平（mRNA-Seq）的折叠变化。仅绘制mTOR平移目标（颜色为浅绿色）。当ISRIB联合用药调节Tm治疗效果时，显著改变的基因以黑色显示（FDR校正的p值<0.1）。(C类)使用或不使用200 nM ISRIB处理细胞1小时。y轴表示ISRIB治疗和对照样品之间核糖体保护片段（Ribo-Seq）的折叠变化。x轴表示ISRIB处理样品和对照样品之间mRNA水平（mRNA-Seq）的折叠变化。仅绘制mTOR平移目标（颜色为浅绿色）。ISRIB-治疗和未治疗（UT）之间mTOR基因的显著变化（FDR-校正p值<0.1）以黑色突出显示。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.05033.006
图1——图补充3。
图1-图补充3.重复核糖体图谱实验的相关图。
在每个实验条件下（未经处理的[UT]、衣霉素[Tm]、衣霉菌素+ISRIB[Tm+ISRIB]和ISRIB），绘制每个基因的检测核糖体（核糖）或mRNA密度。相关系数（r2)重复之间(A类和B类)在每个条件下，每个面板的右下角都会显示。内政部： 网址：http://dx.doi.org/10.7554/eLife.05033.007
图1——图补充4。
图1补充图4：所有基因的平均mRNA丰度。
x轴代表对数2每个mRNA映射的（平均归一化计数）和y轴代表对数2不同实验条件下mRNA丰度的折叠变化：Tm（面板A类)，Tm+ISRIB（面板B类)和ISRIB（面板C类). 先前已知的磷酸化eIF2α依赖的ISR翻译靶点以粉红色突出显示。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.05033.008
图2。
图2.ISRIB阻断eIF2α磷酸化诱导的应激颗粒形成。
(A类)在存在或不存在200 nM ISRIB或1μM GSK797800 PERK抑制剂的情况下，用200 nM Tg处理1小时、250μM Ars处理30分钟或100 nM Pat A处理30分钟的U2OS细胞的免疫荧光分析（eIF3a）。二级Alexa Dye 488抗兔抗体用于显示eIF3a，DAPI用于显示细胞核。显示了至少两个生物复制品的代表性图像。(B类)在下述不同条件下含应激颗粒细胞百分比的定量A类从至少两个独立实验中收集图像，并对具有SG或不具有SG的细胞的数量进行计数。每种条件下计数的细胞总数为（所有重复的总和）：对照（N=81）、ISRIB（N=94）、Tg（N=122）、Tg+ISRIB（N=71）、Ars（N=85）、Ars+ISRIB（N=84）、Pat A（N=47）和Pat A+ISRIB（N=64）。Tg+PERK inh中无SG细胞（N=71）。p值来自学生的t吨-试验，*p<0.05。(C类)U2OS细胞中PERK、磷酸化eIF2α和eIF2总α的免疫印迹分析A类在300 nM的条件下使用Hippuristanol（Hipp）30分钟。右侧印迹过度暴露，以确认Pat A和Hipp治疗后未诱导eIF2α磷酸化。显示了三个独立实验的代表性印迹。星号（*）表示背景波段或降解产物。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.05033.009
图3。
图3.ISRIB的加入迅速溶解活细胞中预先形成的应激颗粒，恢复翻译。
(A类)稳定表达G3BP-GFP（SG标记物）的U2OS细胞中应激颗粒的活细胞成像。在存在或不存在200 nM ISRIB的情况下，用200 nM Tg处理细胞40分钟，250μM Ars处理细胞30分钟，100 nM Pat A处理细胞30 min，或300 nM Hipp处理细胞。使用外荧光显微镜对细胞成像。显示了至少两个生物复制品的代表性图像。(B类)在下述不同条件下含应激颗粒细胞百分比的定量A类从至少两个独立实验中收集图像，并对具有SG或不具有SG的细胞的数量进行计数。每种情况下分析的细胞数量为（重复次数总和）：对照组（N=98）、ISRIB（N=81）、Tg（N=101）、Tg+ISRIB，N=84）、Ars（N=80）、Ars+ISRIB（N=55）、Pat A（N=58），Pat A+ISRIP（N=50）、Hipp（N=41）和Hipp+ISRIC（N=52）。p值来自学生的t吨-试验，*p<0.05。(C类)用Tg预先形成应力颗粒40分钟（如图3A所示），然后将CHX（50μg/ml）或ISRIB（200 nM）添加到孔中，培养10分钟并收集图像。显示了至少两个生物复制品的代表性图像。(D类)ISRIB在应激颗粒分解后迅速恢复mRNA翻译。细胞被视为C类用200 nM Tg静置40分钟，然后同时添加DMSO、CHX（50μg/ml）或ISRIB（200 nM）[35S] -蛋氨酸。15分钟后对细胞进行裂解，将蛋白质放入SDS-PAGE凝胶中，并测量每个通道的放射性（N=2，平均值±SD）。(E类)ISRIB能快速溶解应激颗粒，但不影响P-体。稳定表达G3BP-GFP（SG标记）和Dcp1-RFP（P-body标记）的U2OS细胞的活细胞成像。用200 nM Tg处理细胞45分钟，然后在t=0分钟时向微孔中添加200 nM ISRIB，然后使用旋转圆盘共焦显微镜成像。每30秒采集一次图像。红色箭头指向两个具有代表性的P体。显示了至少三个生物复制品的代表性图像。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.05033.010
图3——图补充1。
图3补充了图1..ISRIB剂量反应和应激颗粒分析中的非活性类似物。
(A类)稳定表达G3BP-GFP的U2OS细胞SGs的活细胞成像。用200 nM Tg和不同剂量的ISRIB（如图所示）或2μM的非活性ISRIB类似物（ISRIB）处理细胞不正确的). 显示了至少两个生物复制品的代表性图像。(B类)在不同条件下含有应激颗粒的细胞百分比的定量。针对每种情况分析的细胞数量为：ISRIB不正确的（N=37），0.5 nM印度标准里布（N=81），2 nM印度基准里布（N=91），10 nM印度标里布（N=43）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.05033.011
图3——图补充2。
图3-图补充剂2.代表性SDS-PAGE凝胶[35S] -蛋氨酸脉冲，如图3D所示。
顶部面板为放射自显影图，底部面板为考马斯染色显示的同一凝胶的总蛋白。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.05033.012
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