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.2015年3月；17(3):300-10.
doi:10.1038/ncb3112。 Epub 2015年2月16日。

ATG12-ATG3与Alix相互作用，促进基础自噬通量和晚期内体功能

林赛·默罗 1, 理马哈特拉 2, 贾扬塔·德伯纳 1
附属公司

ATG12-ATG3与Alix相互作用，促进基础自噬通量和晚期内体功能

林赛·默罗等。 Nat细胞生物学. 2015年3月.

摘要

泛素样分子ATG12是自噬早期步骤所必需的。最近，我们确定ATG3（自噬过程中LC3脂质化所需的E2样酶）为ATG12结合靶点。在这里，我们证明缺乏ATG12-ATG3的细胞损害了基础自噬流量、核周晚期内吞体的积累和内溶酶体的运输。此外，我们确定了ATG12-ATG3和ESCRT相关蛋白Alix（也称为PDCD6IP）之间的相互作用，并证明ATG12-ATM3控制多个Alix依赖过程，包括后期内体分布、外体生物发生和病毒芽变。与ATG12-ATG3类似，Alix在功能上是高效的基础自噬所必需的，但不是饥饿诱导的自噬。总的来说，这些结果确定了核心自噬和ESCRT机制之间的联系，并揭示了ATG12-ATG3在晚期内体功能中的作用，这与ATG在自噬体形成中的典型作用不同。

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数字

图1
图1。ATG12-ATG3促进基础自噬流量
稳定的池自动变速器组3−/−如图所示，将表达空载体对照（pBabe）、野生型小鼠ATG3（WTATG3）或无法与ATG12（KR）结合的ATG3 K243R突变体的MEF用于实验。（a）表达mCherry-GFP-LC3的指示细胞类型为HBSS饥饿2 h。比例尺为20µm。（b）在全培养基中培养表达mCherry-GFP-LC3的指示细胞类型。比例尺，20µm。（c）每个细胞中mCherry阳性、GFP阴性（仅mCherry-only）LC3点百分比的量化，如a–b和补充图1g（平均值±SEM；n=200个来自三个独立实验的细胞）。使用ANOVA计算统计显著性，然后进行Tukey HSD测试（***P<0.001）。（d）每个细胞中仅mCherry（mCherry+/GFP-）或双阳性（mCherly+/GFP+）LC3点数量的量化，如中所述a–b和补充图1g（平均值±SEM；n=从三个独立实验中收集的200个细胞）。使用方差分析计算统计显著性，然后使用Tukey的HSD检验（*P<0.05）。（e）在1%Triton X-100中对指示的细胞类型进行裂解，并对氚可溶和不可溶部分进行抗p62、抗NBR1和抗GAPDH的免疫印迹。右：p62和NBR1蛋白水平的量化（平均值±SEM；p62的n=5个独立实验，NBR1的n=3个独立实验）。使用方差分析计算统计学显著性，然后进行Tukey的HSD检验。（***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05）。另请参见补充图1。斑点的未截取图像如补充图6所示。
图2
图2。缺乏ATG12-ATG3的细胞积聚增大的核周晚期内胚乳
（a）用电子显微镜分析显示的细胞类型。比例尺，1µm。（b）用抗EEA1或抗LAMP1对指示的细胞类型进行免疫染色，以分别标记早期内体和溶酶体。比例尺，10µm。（c）用抗溶血磷脂酸（LBPA）或抗CD63对指示的细胞类型进行免疫染色，以标记晚期内体。比例尺，10µm。（d）用抗LBPA和DAPI对细胞进行免疫染色。核周LBPA+分数被定义为位于细胞核10µm内的LBPA区域的分数。分散LBPA定位的细胞具有核周LBPA+分数接近0.5，而完全聚集LBPA定位的细胞具有核周LBPA+分数接近1。比例尺，10µm。（e）核周LBPA的定量+分数如所述d日（平均值±SEM；n=从三个独立实验中收集的60个细胞）。使用ANOVA计算统计显著性，然后进行Tukey HSD测试（***P<0.001）。（f）LBPA点状细胞平均数量的量化（平均值±SEM；n=来自三个独立实验的60个细胞）。使用ANOVA计算统计显著性，然后进行Tukey HSD测试（***P<0.001）。另请参见补充图2。
图3
图3。ATG12-ATG3促进晚期内体向溶酶体的转运
（a）匹配的野生型和自动变速箱-将缺陷MEF与DQ-BSA在37°C下孵育30分钟，然后在全培养基中孵育2小时。通过流式细胞术分析DQ-BSA去淬法测定的溶酶体降解。当需要时，使用Baf A（50 nM）阻断溶酶体功能。数据表示为平均值±SEM相对荧光（顶部图形的n=3个独立实验，底部两个图形的n=7个独立实验）。使用非配对双尾t检验计算的统计显著性（***P<0.001，**P<0.01）。（b）用抗LC3、抗ATG3和抗ATG12对指示的细胞类型进行裂解和免疫印迹。（c）稳定的复原池自动变速器组3−/−MEF在37°C下与Body-LDL孵育15分钟，然后在全培养基中追逐2小时。用抗LAMP1抗体对细胞进行免疫染色，以标记溶酶体。使用ImageJ中的Colocalization插件将彩色像素高亮显示为白色。比例尺，5µm。（d）与LAMP1共定位的LDL斑点百分比的量化，如c（c）数据以中间值（水平线）、四分位范围（方框）和10–90表示第个百分位数（胡须）；n=100个细胞来自三个独立实验。使用方差分析计算统计显著性，然后进行Tukey HSD检验（**P<0.01）。（e）定量与LBPA共定位的低密度脂蛋白斑点百分比。指示的细胞类型与Bodipy LDL孵育，如c（c）并用抗LBPA免疫染色标记晚期内体。数据以中位数、四分位范围和10-90表示第个百分位数；n=100个细胞来自三个独立实验。使用ANOVA计算统计显著性，然后进行Tukey的HSD测试（***P<0.001，*P<0.05）。另请参见补充图3和4。斑点的未截取图像如补充图6所示。
图4
图4。ATG12-ATG3与Alix交互
（a）如图所示，用mCherry-hALIX、Myc-tagged ATG7（ATG7-Myc）、YFP-ATG12和HA标记的野生型ATG3（WTATG3-HA）或突变型K243R ATG3，转染HEK293T细胞。用抗Alix对裂解物进行免疫沉淀。免疫复合物（IP-Alix）通过SDS-PAGE溶解，并用抗HA和抗Alix进行免疫印迹。（b）用ATG12抗体对具有指定基因型的MEF进行裂解和免疫沉淀。免疫复合物（IP-ATG12）通过SDS-PAGE溶解，并用抗Alix、抗ATG12和抗ATG3进行免疫印迹。（c）本研究中使用的Alix和截断突变体中保守结构域的示意图。数字代表缺失突变体的N端和C端氨基酸残基。（d）用YFP-ATG12和指示的mCherry-hALIX截短突变体转染HEK293T细胞。用抗mCherry免疫沉淀裂解液。免疫复合物（IP-mCherry）通过SDS-PAGE进行解析，并用抗RFP和抗ATG12进行免疫印迹。（e）Alix中保守结构域和蛋白质结合位点的示意图。（f）HEK293T细胞转染CHMP4B-myc、ATG7-myc、YFP-ATG12和HA标记的野生型ATG3（WTATG3-HA）或突变型K243R ATG3。用抗Alix免疫沉淀裂解液。免疫复合物（IP-Alix）通过SDS-PAGE溶解，并用所示抗体进行免疫印迹。底部：共免疫沉淀CHMP4B的定量（平均值±SEM；n=5个独立实验）。使用ANOVA计算统计显著性，然后使用Tukey的HSD测试。（g）如图所示，用YFP标记的小鼠白血病病毒Gag（Gag-YFP）、ATG7-myc、YFP-ATG12和HA标记的野生型ATG3（WTATG3-HA）或突变型K243ATG3（KR-HA）转染HEK293T细胞。用抗Alix免疫沉淀裂解液。免疫复合物（IP-Alix）通过SDS-PAGE溶解，并用所示抗体进行免疫印迹。底部：联合免疫沉淀MLV Gag定量（平均值±SEM；n=3个独立实验）。使用方差分析计算统计显著性，然后进行Tukey HSD检验（**P<0.01，*P<0.05）。另请参见补充图5。斑点的未截取图像如补充图6所示。
图5
图5。ATG12-ATG3共轭现象缺失Alix缺失
（a）用抗ALIX（siALIX）、VPS24（siVPS24）或非靶向对照（siCTL）的siRNA转染指示的细胞类型，并用抗LBPA免疫染色标记晚期内体。比例尺，10µm。右：核周LBPA定量+如图2d所示的分数（平均值±SEM；n=来自三个独立实验的60个细胞）。使用ANOVA计算统计显著性，然后进行Tukey HSD测试（***P<0.001）。对匹配的裂解物进行抗Alix和抗Vps24的免疫印迹。（b）所示细胞类型在37°C下隔夜无血清培养，然后用100 ng/mL EGF处理所示时间。对裂解液进行抗磷酸化ERK1/2（pERK1/2）、抗ERK1/2、抗磷酸化AKT（pAKT）和抗AKT的免疫印迹。右：磷酸化ERK和AKT水平的量化（平均SEM；n=3个独立实验）。使用ANOVA计算统计显著性，然后使用Tukey的HSD测试。斑点的未截取图像如补充图6所示。
图6
图6。ATG12-ATG3共轭促进多个Alix函数
（a）通过SDS-PAGE解析所示细胞类型的全细胞裂解物（WCL）和外体部分（Exo），并用考马斯染色（左）或免疫印迹法检测外体标记物抗Alix、抗TSG101、抗GAPDH和抗HSC70（右），以测量相对外体释放。底部：外体蛋白释放定量（平均值±SEM；Alix和GAPDH的n=7个独立实验，HSC70的n=6，TSG101的n=5）。使用ANOVA计算统计显著性，然后进行Tukey的HSD检验（***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05）。（b）用SDS-PAGE和免疫印迹法对转染抗Alix（Alix）siRNA或非靶向对照（CTL）siRNA的野生型MEF的全细胞裂解物（WCL）和外体部分（Exo）进行解析，以获得外体标记物anti-Alix和anti-HSC70，以测量相对外体释放。底部：外体HSC70蛋白水平的量化（平均值±SEM；n=3个独立实验）。使用非配对双尾t检验计算的统计显著性（***P<0.001）。（c）用YFP标记的鼠白血病病毒Gag（MLV-Gag-YFP）转染指示的细胞类型。类病毒颗粒（VLP）和全细胞裂解物（WCL）通过SDS-PAGE进行解析，并通过免疫印迹法检测抗Gag抗体，以测量相对病毒芽变。底部：Gag释放的量化（平均值±SEM；n=4个独立实验）。使用方差分析计算统计显著性，然后进行Tukey HSD检验（**P<0.01，*P<0.05）。斑点的未截取图像如补充图6所示。
图7
图7。Alix的丢失特别损害了基础自噬流量
（a） 自动变速器组3+/+表达mCherry-GFP-LC3的MEF用抗ALIX（siALIX）或非靶向对照（siCTL）的siRNA转染，HBSS饥饿2h，比例尺15µm。（b） 自动变速器组3+/+用siALIX或siCTL转染表达mCherry-GFP-LC3的MEF，并在全培养基中生长。比例尺，15µm。（c） 自动变速器组3+/+用抗ALIX的siRNA（siALIX）或非靶向对照（siCTL）转染表达mCherry-GFP-LC3的MEFs，并用Baf a（50nM）处理2小时以阻断溶酶体功能。比例尺，15µm。（d）左：每细胞mCherry-阳性、GFP-阴性（仅mCherry）点状细胞百分比的量化，如a–c（平均值±SEM；n=从三个独立实验中收集的100个细胞）。使用ANOVA计算统计显著性，然后进行Tukey HSD测试（***P<0.001）。右图：显示的细胞在全培养基中生长、裂解并免疫印迹以检测抗Alix。（e） 自动变速器组3+/+用siALIX或非靶向对照（siCTL）转染MEF，在1%Triton X-100中溶解，并用抗p62、抗NBR1和抗Alix进行免疫印迹。右：p62和NBR1蛋白水平的量化（平均值±SEM；p62的n=5个独立实验，NBR1的n=3个）。使用ANOVA计算统计显著性，然后进行Tukey的HSD测试（***P<0.001，*P<0.05）。（f）稳定的野生型或第5天−/−用抗Alix（Alix）或非靶向对照（CTL）的siRNA转染表达FLAG-HA-ATG12（FHA-ATG1 2）的MEF。对裂解液进行抗HA、抗Alix和抗ATG3的免疫印迹。斑点的未裁剪图像如补充图6所示。
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