跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2015年1月22日；57(2):207-18.
doi:10.1016/j.molcel.2014.11.013。 Epub 2014年12月18日。

mTORC1磷酸化UVRAG负调控自噬体和内体成熟

Young-Mi Kim（金永美） 1, 张华荣（Chang Hwa Jung） 2, Minchul Seo先生 1, 金恩京 三, 吉曼公园 1, 孙思培 4, Do-Hyung Kim先生 5
附属公司

mTORC1磷酸化UVRAG负调控自噬体和内体成熟

Young-Mi Kim（金永美）等。 分子电池. .

摘要

mTORC1作为负调控因子在自噬中起关键作用。目前已知的自噬途径中mTORC1的靶点主要在自噬体形成的早期阶段发挥作用。在这里，我们发现mTORC1通过磷酸化UVRAG来抑制后期的自噬。在营养丰富的条件下，mTORC结合并磷酸化UVRAG。磷酸化积极调节UVRAG-与RUBICON的结合，从而增强RUBICON对UVRAG-介导自噬小体成熟的拮抗作用。在去磷酸化后，UVRAG从RUBICON中释放出来，与HOPS复合物相互作用，HOPS复合体是晚期内吞体和溶酶体融合机制的组成部分，并促进自噬体和内吞体的成熟。因此，UVRAG的去磷酸化促进表皮生长因子受体（EGFR）的溶酶体降解，减少EGFR信号传导，并抑制癌细胞增殖和肿瘤生长。这些结果表明，mTORC1参与了自噬和内体成熟的晚期阶段，在膜相关过程中定义了更广泛的mTORCl功能。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。mTORC1与UVRAG结合并诱导UVRAG-磷酸化
(A类)mTOR与含UVRAG的Vps34复合物结合。Myc标记的蛋白质在HEK293T细胞中瞬时表达。采用免疫印迹法（WB）分析用myc免疫沉淀物（IP）恢复的内源性mTOR。(B类)mTORC1与UVRAG相互作用。Myc-tagged蛋白在HEK293T细胞中用HA-UVRAG瞬时表达。WB分析用myc IP恢复的UVRAG。中间一条不相关的车道被取消。(C类)WB分析用RUBICON、猛禽和对照IgG IP恢复的内源性UVRAG。(天)UVRAG-mTORC1相互作用受Torin1或HBSS负调控，但不受雷帕霉素负调控。瞬时转导HEK293T细胞表达myc-UVRAG，在HBSS中孵育2h或用Torin1或雷帕霉素处理1h。WB分析用myc-UVRAG分离的内源性mTOR或雷帕藤。(电子)mTOR抑制诱导SDS-PAGE上UVRAG带的迁移。HEK293T细胞在DMEM或HBSS中培养2 h，或用Torin1处理1 h。细胞也在亮氨酸产生的培养基（−）中培养，然后补充亮氨酸（+）。(F类)MEF中TSC1或TSC2的缺乏导致UVRAG的迁移率改变(G公司)mTOR在体外磷酸化UVRAG。从细菌中制备GST标记的UVRAG片段，并与活性mTOR片段在32P-ATP。成立32通过放射自显影术分析UVRAG片段中的P。另请参见图S1。
图2
图2。UVRAG Ser498是mTORC1依赖性磷酸化位点
(A类)围绕UVRAG S498的序列与已知mTORC1靶点的序列对齐。(B类)Rheb诱导UVRAG S498磷酸化。HA-Rheb在HEK293T细胞中用myc-UVRAG表达。WB分析UVRAG S498磷酸化。(C类)MEF中的UVRAG磷酸化被Torin1、Akt抑制剂VIII或HBSS抑制，但不被雷帕霉素抑制。免疫沉淀UVRAG通过WB分析磷酸化。(天)Akt和Rheb增强了S498磷酸化。HA-UVRAG仅在HEK293T细胞（−）中瞬时表达，或与myc标记的组成活性Akt突变体（cAkt）或Rheb一起瞬时表达。转染后两天，用载体（−）或Torin1（+）处理细胞1小时(电子)MEF中AMPK、PTEN或TSC1的缺乏会增强UVRAG磷酸化。用载体（−）或Torin1（+）处理MEFs 1小时。通过免疫沉淀和WB分析UVRAG磷酸化。另请参见图S2。
图3
图3。mTORC1磷酸化UVRAG Ser498
(A类)mTOR在体外磷酸化UVRAG S498。将mTOR的活性形式与纯化的UVRAG在ATP存在下孵育。Akt1作为阴性对照。WB分析UVRAG S498磷酸化。(B类)使用抗Myc抗体通过免疫沉淀法分离在HEK293T细胞中瞬时表达的Myc-mTOR WT或其激酶死亡突变体（KD），并与UVRAG和ATP孵育。(C类)从HEK293T细胞中分离出内源性mTOR IP，并以UVRAG 271-699片段为底物分析其激酶活性。(天)mTOR、raptor或rictor IP是从HEK293T或HeLa细胞中获得的，激酶反应分析如（C）所示。(电子)分析从shRNA转导的HEK293T细胞中分离的内源性UVRAG中S498的磷酸化状态。(F类)Torin1在体外抑制UVRAG S498磷酸化。mTOR活性片段与从细菌中纯化的UVRAG WT或S498A孵育。在有或无Torin1的情况下进行激酶反应。另请参见图S3。
图4
图4。UVRAG Ser498磷酸化正调控UVRAG-RUBICON相互作用
(A类)S498磷酸化正向调节UVRAG-RUBICON相互作用。Myc-UVRAG WT或突变体在UVRAG-沉默的HEK293T细胞中瞬时表达。WB分析用myc-UVRAG IP恢复的内源性RUBICON。(B类)Torin1负调节UVRAG-RUBICON相互作用。用Torin1处理HEK293T细胞4h。通过免疫沉淀和WB分析内源性UVRAG和RUBICON之间的相互作用。(C类)亮氨酸剥夺减少UVRAG-RUBICON相互作用。HEK293T细胞在含有（+）或不含亮氨酸（-）的培养基中培养2 h。用WB分析用UVRAG IP回收的内源性RUBICON。(天)S498A突变对RUBICON与含UVRAG的Vps34复合物之间的相互作用产生负面影响。所示蛋白在UVRAG-沉默的HEK293T细胞中表达。转染后两天，用Torin1处理细胞，如（B）所示。另请参见图S4。
图5
图5。UVRAG Ser498磷酸化对RUBICON对Vps34的抑制作用很重要
(A类)S498磷酸化的预防增加了PI3P在HeLa细胞中的积累。RFP标记的2xFYVE在WT或突变UVRAG重组HeLa细胞中瞬时表达，并通过荧光显微镜进行监测。比例尺，10μm。(B类)FYVE斑点形成的定量分析。结果表示为平均值±标准偏差（SD）（*，对<0.05 vs WT；**，与WT相比p<0.01；#，对<0.01; n≥17）。(C类)阻止S498磷酸化增加Vps34的激酶活性。HA-Vps34在UVRAG-缺失的HEK293T细胞中单独或与myc-UVRAG一起表达。获得HA-Vps34 IP，并与磷脂酰肌醇（PI）和ATP在存在或不存在沃特曼（200 nM）的情况下孵育。PI3P的含量按照实验程序进行分析。(天)Vps34激酶活性的定量分析。结果表示为平均值±SD（*，对<0.01 vs空向量；#，对<0.01; NS，无显著性；n=3）。(电子)RUBICON依赖S498磷酸化来抑制UVRAG诱导的PI3P的产生。如（A）所述，分析空腹载体或UVRAG转导的HCT116细胞中单独（−）或与RUBICON一起表达的RFP-2xFYVE。比例尺，5μm。(F类)PI3P斑点形成的定量分析。误差条表示平均值±SD(#，对<0.01; n=20）。(G和H)RUBICON依赖S498磷酸化来抑制UVRAG介导的Vps34激酶活性刺激。用空载体或RUBICON构建物瞬时转染UVRAG重建的HEK293T细胞。体外激酶测定如（C）所示。该图代表了两个独立的实验。(我)WB分析用Vps34 IP恢复的Vps34。另请参见图S5。
图6
图6。预防UVRAG Ser498磷酸化促进自噬体成熟
(A类)S498磷酸化负调控UVRAG-Vps39相互作用。HA-Vps39在UVRAG重组HEK293T细胞中瞬时表达，并通过免疫沉淀和WB分析其相互作用。(B类)S498磷酸化负调节UVRAG-Vps16相互作用。WB分析用GFP-UVRAG IP从HEK293T细胞中回收的Myc-Vps16。(C类)Torin1增强UVRAG-Vps39相互作用。用Torin1或载体（−）处理瞬时表达HA-Vps39和myc-UVRAG的HEK293T细胞。WB分析用myc-UVRAG IP回收的HA-Vps39。(天)RUBICON敲除增强了WT细胞中的UVRAG-Vps16相互作用，但不增强S498A细胞中的相互作用。WB分析用myc-UVRAG IP从shRNA转导的HEK293T细胞中回收的GFP-Vps16。(电子)S498磷酸化负调控Rab7-RILP相互作用。用HA-RILP从WT或突变UVRAG-重组HEK293T细胞中回收的Rab7用WB分析。(F类)S498磷酸化负调节Rab7。如实验程序所述，检测到GTP结合的Rab7。(G公司)（F）的定量分析。数据为平均值±SD（n=2）。(H（H）)S498磷酸化负调控自噬体成熟。mCherry-GFP-LC3在空载体或UVRAG转导的HCT116细胞中表达。用Torin1或载体处理细胞。LC3通过荧光显微镜进行监测。比例尺，5μm。(单元节点号)GFP puncta（I）和mCherry putta（J）的定量分析（*，对<0.01 vs空向量；#，p<0.01；NS；n≥35）。平均值显示为水平条。(K（K）)纯樱桃斑点的定量分析（*，对<0.01 vs空向量；#，对<0.01; n≥35）。平均值和SD显示为水平条。(L（左）)S498A突变增强了自噬通量。在Bafilomycin A1（exp1）或E-64/Pepstatin A（exp2）存在或不存在的情况下，用Torin1处理用UVRAG构建物重建的HEK293T细胞。(M（M）)定量分析溶酶体抑制剂诱导Torin1处理细胞中LC3-II水平增加的倍数。数据为平均值±SD（*，对<0.05; n=5）。另请参见图S6。
图7
图7。预防UVRAG Ser498磷酸化增强EGFR降解，减少EGFR信号传导，抑制癌细胞增殖和肿瘤生长
(A类)S498A突变增强EGFR降解。用空载体（−）或UVRAG构建物稳定转导的HEK293T细胞隔夜缺乏血清，并处理EGF。WB分析细胞裂解液中EGFR水平。(B类)EGFR水平相对于时间零点时的EGFR水平。数据为平均值±SD（n=4）。(C类)S498A突变抑制EGFR信号。HEK293T细胞，如（A）所示转导，隔夜无血清，并用EGF处理。通过WB分析pERK1/2（Thr202/Tyr204）或pAKT（Thr308）。(天)S498A突变抑制癌细胞增殖。用空载体（−）或UVRAG构建物稳定转导的HCT116细胞在DMEM中培养。用血细胞仪计数活细胞数。数据为平均值±SD（n=3）。(电子)使用MTT分析活细胞。数据为平均值±SD（n=3）。(F类)S498A突变显著抑制癌细胞的锚定非依赖性生长。使用按（D）制备的HCT116细胞。数据显示为平均值±SD（*，对<0.01 vs空向量；#，对<0.01; n=3）。(G公司)S498A突变显著抑制小鼠肿瘤生长。数值代表平均值±SD（*，对=0.012; n=5）。(H（H）)分析肿瘤重量与全身重量的关系。数值代表平均值±SD（*，对<0.01; n=5）。(我)UVRAG S498磷酸化在自噬体和内体成熟中的调节作用。另请参见图S7。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

中的注释

  • ZMP：单碳代谢的主调节器。
    Ducker GS，Rabinowitz JD。 Ducker GS等人。 分子细胞。2015年1月22日；57（2）：203-4。doi:10.1016/j.molcel.2015.01.012。 分子细胞。2015 PMID：25616065 免费PMC文章。

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Chang YY，Neufeld TP公司。在TOR介导的自噬调节中具有多重作用的Atg1/Atg13复合物。分子生物学细胞。2009;20:2004–2014.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 崔毅，赵Q，高C，丁毅，曾毅，上田T，中野A，蒋L.MON1-CCZ1复合物激活Rab7 GTPase对拟南芥中PVC-液泡贩运和植物生长至关重要。植物细胞。2014;26:2080–2097.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Dunlop EA、Hunt DK、Acosta-Jaquez HA、Fingar DC、Tee AR.ULK1抑制mTORC1信号传导，促进多位点猛禽磷酸化并阻碍底物结合。自噬。2011;7:737–747.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Egan DF、Shackelford DB、Mihaylova MM、Gelino S、Kohnz RA、Mair W、Vasquez DS、Joshi A、Gwinn DM、Taylor R等。AMP活化蛋白激酶对ULK1（hATG1）的磷酸化将能量感应与有丝分裂联系起来。科学。2011;331:456–461.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Farkas T，Daugaard M，Jaattela M。磷脂酰肌醇3-激酶小分子抑制剂和自噬的鉴定。生物化学杂志。2011;286:38904–38912。-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

MeSH术语