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.2014;13(19):3143-9.
doi:10.4161/15384101.2014.949550。

小分子FAK激酶抑制剂GSK2256098抑制胰腺导管腺癌细胞的生长和存活

张建良 1, 迪华河, 玛丽亚·扎贾克·凯, 史蒂文·霍奇瓦尔德
附属公司

小分子FAK激酶抑制剂GSK2256098抑制胰腺导管腺癌细胞的生长和存活

张建良等。 细胞周期. 2014.

摘要

局灶性黏附激酶（FAK）过度激活在胰腺导管腺癌（PDAC）中很常见。已开发出一种小分子GSK2256098（葛兰素史克），通过靶向FAK的磷酸化位点酪氨酸（Y）397来抑制FAK活性。我们试图确定GSK2256098抑制FAK Y397磷酸化是否会减弱PDAC相关细胞的增殖、运动和存活。培养的PDAC细胞被用作GSK2256098异常生长受损的细胞模型。进行Western blot分析、细胞活性分析、克隆形成存活率、软糖和伤口愈合分析。6个PDAC细胞系对FAK Y397磷酸化或活性的反应在GSK2256098处理（0.1-10μM）的低（抑制率低于20%）到高（抑制率高于90%）之间。选择敏感性最低和最高的细胞系（PANC-1和L3.6P1）进行进一步分析。GSK2256098抑制FAK Y397磷酸化与L3.6P1细胞中磷酸化Akt和ERK水平降低相关。GSK2256098以剂量依赖的方式降低了细胞活力、锚定非依赖性生长和运动性。目前的研究表明，针对FAK Y397磷酸化的小分子激酶抑制剂可以抑制PDAC细胞的生长。活检中FAK Y397磷酸化的评估可作为生物标记物，用于选择应答患者的亚组和/或监测GSK2256098在治疗期间对FAK调节的肿瘤生长的影响。

关键词：阿克特；FAK抑制剂；FAK，粘着斑激酶；葛兰素史克2256098；葛兰素史克2256098；胰岛素样生长因子1受体；PDAC；PDAC，胰腺导管腺癌；肿瘤生长；信号。

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数字

图1。
图1。
GSK2256098抑制FAK Y397磷酸化。人PDAC细胞系Miapaca、PANC-1、Hs766T、Aspc-1、L3.6P1和BXPC-3在含有10%FBS和抗生素的DMEM、RPMI-1640或GMEM培养基中培养。细胞单层在添加蛋白酶抑制剂的NP-40裂解缓冲液中进行裂解。蛋白质在8%聚丙烯酰胺凝胶上分离，并印在聚偏氟乙烯膜上。使用抗磷酸化Y397 FAK抗体。使用抗FAK 4.47和抗GAPDH抗体剥离并重新保护相同的膜，以检测总FAK水平和GAPDH水平作为负荷控制。使用image J软件评估FAK Y397磷酸化的强度，并将其归一化为总FAK（下条形图）的强度。
图2。
图2。
GSK2256098对Akt和ERK磷酸化的抑制。PANC-1和L3.6P1细胞在含有10%FBS和抗生素的DMEM或GMEM培养基中培养。细胞单层在添加蛋白酶抑制剂的NP-40裂解缓冲液中进行裂解。蛋白质在8%聚丙烯酰胺凝胶上分离，并印在聚偏氟乙烯膜上。使用抗磷酸-Akt抗体。使用抗Akt或抗GAPDH抗体剥离相同的膜并进行再验证，以检测总Akt和GAPDH水平。评估Akt和ERK磷酸化的强度，并将其归一化为总Akt或ERK（下条形图）的强度。
图3。
图3。
GSK2256098对PARP和caspase水平的影响。PANC-1和L3.6P1细胞在含有10%FBS和抗生素的DMEM或GMEM培养基中培养。细胞单层在添加蛋白酶抑制剂的NP-40裂解缓冲液中进行裂解。蛋白质在8%聚丙烯酰胺凝胶上分离，并印在聚偏氟乙烯膜上。使用抗PARP抗体。分别使用抗Caspase-8、Caspase-9和抗GAPDH抗体剥离并重新保护同一膜。
图4。
图4。
GSK2256098降低细胞活力。PANC-1和L3.6P1培养在96个平板的孔中。将细胞在0.1、0.5、1、2.5、5、10、25、50、75、100和200μM的GSK中培养72小时。将MTS溶液添加到孔中并培养1小时。记录490 nm处的吸光度并用于计算IC50（PANC-1细胞为29μM，L3.6P1细胞为25μM）。
图5。
图5。
GSK2256098对菌落形成和凤尾鱼非依赖性生长的抑制。(A类)将PANC-1和L3.6P1细胞在含有0.1–10μM GSK2256098的培养基中培养48–72小时。对细胞进行染色和计数。(B类)计算GSK2256098抑制克隆形成的百分比。(C类)凤尾鱼非依赖性生长的软琼脂试验。将含有琼脂糖溶液和0–25μM GSK2256098的生长培养基中的细胞涂布在底部培养基-琼脂层的顶部。21天后，细胞被结晶紫染色，菌落在整个培养皿中计数，并归一化为对照细胞（无药物）。**：P（P）<0.01，GSK2256098的10μM下L3.6P1与PANC-1，n=3，T检验；和***：P（P）<0.001，L3.6P1 vs PANC-1，GSK2256098的25μM），n=3。
图6。
图6。
GSK2256098抑制细胞运动。(A类)在PANC-1和L3.6P1细胞达到>90%的融合后，刮伤单层并在显微镜下检查（0小时）。细胞单层在含有1–25μM GSK2256098的培养基中培养48小时，然后在显微镜下重新检查。显示了具有代表性的显微图像。(B类)评估了PANC-1的间隙距离，并计算了相对迁移。*：P（P）<0.05 vs对照组（0μM GSK2256098），n=3-4，单向方差分析。(C类)评估L3.6P1的间隙距离，并计算相对迁移。*：P（P）<0.05 vs对照组（0μM GSK2256098），n=3-4，单向方差分析。
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