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.2014年11月20日；9(4):1281-91.
doi:10.1016/j.celrep.2014.10.019。

芝麻素通过GATOR复合物抑制mTORC1激酶活化

安妮塔·帕尔米吉亚尼, 艾达·努尔巴赫什, 博协鼎, 王伟（音译）, 年轻的Chul Kim, Konstantin Akopiants公司, 关坤良, 迈克尔·卡林, 安德烈·巴达诺夫

芝麻素通过GATOR复合物抑制mTORC1激酶活化

安妮塔·帕米吉亚尼等。 单元格代表. .

摘要

雷帕霉素复合物1（mTORC1）激酶的机制靶点是不同环境条件的传感器以及细胞生长、代谢和自噬的调节器。mTORC1被Rag GTPases激活，作为RagA:RagB和RagC:RagD异二聚体。Rags通过将mTORC1连接到溶酶体上，在溶酶体中被Rheb GTPase激活，从而控制mTORCl的活性。RagA:RagB以GTP-结合形式激活，被GTPase激活蛋白GATOR1复合物抑制，GATOR1-反过来被GATOR2复合物负调控。芝麻素是一种应激反应蛋白，通过激活AMP-活化蛋白激酶（AMPK）和结节性硬化复合物抑制mTORC1。在此，我们报道了Sestrins通过与GATOR2相互作用介导的mTORC1抑制的AMPK非依赖性机制。由于这种相互作用，Sestrins以Rag依赖的方式抑制mTOR溶酶体定位。这种机制可能涉及氨基酸、鱼藤酮和衣霉素对mTORC1的调节，将应激反应与mTORCl抑制联系起来。

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数字

图1
图1。Sestrins以AMPK无关的方式抑制mTORC1并与GATOR2相互作用
（A） 不朽的AMPK公司α−/−将HA-p70S6K与表达GFP或Sesn2的构建物共同转染MEF细胞。48小时后，裂解细胞，用抗HA珠免疫沉淀HA-p70S6K，并用免疫印迹法分析相应蛋白的磷酸化和表达。（B） Sesn2直接与GATOR2相互作用，但不与GATOR1相互作用。将Flag-Sesn2与HA-标记的GATOR2或GATOR1表达结构共同转染到HEK293T细胞，用抗Flag珠免疫沉淀，并用抗HA或抗Flag-抗体进行免疫印迹分析。（C） Sesn2绑定GATOR2在体外GATOR2用抗标记物从HEK293T细胞中纯化，用标记肽洗脱，与细菌纯化的GST-Sesn2或对照GST-GFP蛋白孵育过夜，然后用HA或GST抗体进行免疫印迹分析。（D） Sesn1绑定GATOR2。将Flag-Sesn1S-、Flag-Sesn1L-或Flag-Sesn2-与表达GATOR2的构建体一起共转染，并如（B）中那样通过免疫印迹进行分析。（E） 内源性Sesn2与未转化MCF10A乳腺上皮细胞中的GATOR2 Mios蛋白相互作用。用抗Sesn2抗体免疫沉淀内源性Sesn2（使用相同类型的抗GFP抗体作为对照），并用抗Mios和抗Sesn1抗体免疫印迹。（F） 内源性Sesn2与不同人类肿瘤细胞系中的Mios相互作用。实验按（E）进行。（G） 不同的应力条件会影响Sesn2-Mios相互作用。用不含AA的培养基处理MCF10A细胞，如（E）所示，检测阿霉素、2DG和膜霉素和Sesn2-Mios的相互作用。
图2
图2。Sesn2不会破坏GATOR1–GATOR2的相互作用，也不会与单独的GATOR2成分相互作用
（A） Sesn2在GATOR2在场的情况下与GATOR1相互作用。HEK293T细胞与所有HA标记的GATOR表达质粒共同转染Flag-Sesn2-或GFP-表达构建物。用抗Flag珠免疫沉淀Flag-Sesn2，用抗Flang或抗HA抗体免疫印迹分析Sesn2复合物和细胞裂解物中的蛋白质。（B） Sesn2的过度表达不影响GATOR1–GATOR2相互作用。所有GATOR蛋白均在Sesn2或GFP存在下体外表达，通过Flag-Nprl2和抗Flag珠免疫沉淀，并通过免疫印迹分析，如（A）所示。（C） Sesn2不影响GATOR1和GATOR2之间的相互作用在体外所有GATOR蛋白均在HEK293T细胞中表达。含有Flag-Nprl2和其他HA-标记GATOR蛋白的免疫复合物用抗Flag珠分离，与细菌纯化的GST-Sesn2孵育过夜，并用免疫印迹法进行检测，如（A）所示。（D） Sesn2的过度表达对GATOR-RagA:B相互作用没有强烈影响。HEK293T细胞感染Sesn2-或对照GFP-表达结构，用抗RagA或对照抗PDGFRβ抗体免疫沉淀Rag复合物，并用抗Rag A和抗Mios抗体免疫印迹分析。（E） Sesn2与整个GATOR2相互作用，但不与其单独的组件相互作用。将Flag-Sesn2表达结构与GATOR2表达结构的不同组分组合（HA-WDR59、HA-WDR2、HA-Mios、HA-Seh1L和HA-Sec13）共同转染到HEK293T细胞中。用抗Flag珠拖出Flag-Sesn2复合物，并用免疫印迹法进行分析，如（A）所示。（F） Sesn2与WDR24和Seh1L蛋白的组合相互作用。将Flag-Sesn2表达质粒与WDR24-、Seh1L-和WDR59-表达结构的不同组合联合转染。用抗Flag珠免疫沉淀Flag-Sesn2复合物，并用免疫印迹法进行分析，如（A）所示。
图3
图3。Sesn2以GATOR依赖方式抑制mTORC1
在DEPDC5沉默的HEK293T细胞中，Sesn2对mTORC1的抑制作用减弱。将HA-p70S6K与表达shLuc-或shDEPDC5的构建物联合Sesn2-或GFP-表达的构建物共同转染HEK293T细胞，用抗-HA珠免疫沉淀HA-p70S6K，然后用所示抗体进行免疫印迹分析。（B） 敲除DEPDC5或Seh1L会破坏Sesn2对MCF10A细胞中mTORC1的抑制作用。DEPDC5或Seh1L沉默的细胞被表达Sesn2或GFP的慢病毒感染。免疫印迹法检测蛋白磷酸化和表达。（C） 用qPCR检测（B）中DEPDC5或Seh1L的抑制作用。（D，E）Sesn2以依赖DEPDC5的方式抑制细胞生长（D）和细胞周期（E）。用流式细胞术测定DEPDC5沉默或对照表达Sesn2或GFP的MCF10A细胞的细胞大小和细胞周期。（F） DEPDC5和TSC2沉默对H1299细胞中Sesn2抑制mTORC1的作用的比较。实验按（B）进行。（E）和（C）中的结果为平均值±标准偏差。**通过Student t检验，表示p<0.01和***p<0.001。
图4
图4。Sesn2通过Rag依赖性抑制mTOR溶酶体定位抑制mTORC1活性
（A） Sesn2抑制溶酶体mTOR在对照和AA刺激的细胞中的定位。用Sesn2或对照pLU慢病毒构建物感染HEK293T细胞，在无AA培养基中保存50分钟，用AA再刺激10分钟，然后用抗mTOR和抗LAMP2抗体进行免疫染色。（B） 使用ZEN Litr 2012软件确定（A）中LAMP2和mTOR1之间的重叠。（C） Sesn2在对照和AA刺激的细胞中抑制mTORC1活性。HEK293T细胞按（A）处理，用磷酸化S6、S6和Sesn2抗体进行裂解和免疫印迹。（D） 组成活性RagC的过度表达S75N系列和/或RagBQ99升蛋白质破坏了Sesn2对mTORC1的抑制作用。HEK293T细胞与Myc-p70S6K-以及Sesn2-或GFP-表达构建物共同转染，无论是否存在组成活性RagCS75N系列和/或RagBQ99升用抗Myc抗体免疫沉淀Myc-p70S6K，通过免疫印迹分析相应蛋白的磷酸化和表达。（E） Sesn2对mTORC1的抑制作用在图A:B−/−细胞。图A:B−/−用HA-p70S6K-和表达Sesn2-或GFP-的构建物共同转染细胞或WT对应物，48小时后裂解。HA-p70S6K用抗-HA微球免疫沉淀并进行免疫印迹分析。（F） Sesn2沉默增强AA对mTORC1的再刺激。Sesn2或对照DEPDC5或TSC2基因被shRNA慢病毒沉默，在无AA培养基中培养50分钟，用AA刺激10分钟。通过免疫印迹法测定HA-p70S6K的磷酸化和表达。
图5
图5。鱼藤酮和Tunicamycin通过Sesn2激活调节mTORC1
鱼藤酮（A、B和C）以Sesn2-、DEPDC5-和TSC2依赖和AMPK-独立的方式抑制mTORC1。（A） 用鱼藤酮处理Sesn2沉默或对照H1299细胞10小时，并通过免疫印迹法测定指示蛋白的磷酸化和表达。（B）Sesn2号机组+/+和Sesn2号机组−/−用鱼藤酮处理永生化MEF，并用免疫印迹法进行分析，如（A）所示。（C） 鱼藤酮以依赖DEPDC5和TSC2的方式调节mTORC1。用鱼藤酮处理DEPDC5或TSC2-silenced细胞或对照细胞，并按（A）进行分析。（D） 卡霉素以Sesn2依赖的方式抑制mTORC1。用衣霉素处理Sesn2沉默或对照H1299细胞10小时，并通过免疫印迹法测定相应蛋白的磷酸化和表达。（E） 一种表明Sestrins通过Rag依赖机制调节mTORC1的方案。Sesn2与GATOR2相互作用，抑制其活性，导致GATOR超复合体内GATOR1激活，并抑制Rag依赖性mTORC1向溶酶体膜的募集。
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