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.2014年10月6日；24(19):2274-80.
doi:10.1016/j.cub.2014.08.007。 Epub 2014年9月11日。

mTORC1/S6K1通路通过eIF4B依赖性控制c-Myc翻译调节谷氨酰胺代谢

阿尔弗雷多·西比 1, 李千娜 1, Sang-Oh Yoon先生 1, 郝轩彤（Haoxuan Tong） 2, 迪登·伊尔特 三, 伊利亚·埃利亚 4, 萨拉·玛丽亚·芬特 4, 托马斯·罗伯茨 2, 约翰·布莱尼斯 5
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mTORC1/S6K1通路通过eIF4B依赖性控制c-Myc翻译调节谷氨酰胺代谢

阿尔弗雷多·西比等。 当前生物. .

摘要

促生长信号分子，包括雷帕霉素复合物1（mTORC1）的哺乳动物靶点，驱动癌细胞的代谢重编程，以支持其快速生长和增殖的生物合成需求。谷氨酰胺通过两个脱氨反应分解为α-酮戊二酸（αKG），这是一种三羧酸（TCA）循环中间产物，第一个脱氨作用需要谷氨酰胺酶（GLS）生成谷氨酸，第二个脱氨过程通过谷氨酸脱氢酶（GDH）或转氨酶发生。先前已经证明，mTORC1通路的激活可以促进谷氨酰胺通过GDH进入TCA循环。此外，mTORC1激活也刺激谷氨酰胺的摄取，但其机制尚不清楚。一般认为，谷氨酰胺利用率受线粒体通过GLS摄取的限制，这表明除GDH外，mTORC1还可以调节GLS。在这里，我们证明mTORC1通过该酶正向调节GLS和谷氨酰胺流量。我们证明，mTORC1通过S6K1依赖性调控c-Myc（Myc）来控制GLS水平。在分子水平上，S6K1通过调节真核生物起始因子eIF4B的磷酸化来提高Myc翻译效率，该因子对解开其结构5'非翻译区（5'UTR）至关重要。最后，我们的数据表明，GLS的药理抑制是胰腺癌表达低水平PTEN的一个有希望的靶点。

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数字

图1
图1。mTORC1通路调节GLS1
（A-C、E）全细胞裂解物中的GLS蛋白水平来自：（A） Tsc2型WT和Tsc2型雷帕霉素处理−/−MEF 8h；（B）稳定表达Rheb WT、突变体S16H Rheb或空载体（EV）的HEK293T细胞，用雷帕霉素处理24h；（C） Tsc2型在指定的时间点用雷帕霉素处理−/−MEF；（E） Tsc2型WT和Tsc2型用所示化合物处理8小时的−/−MEF。化合物的浓度为：雷帕霉素20ng/mL；LY294002 20μM和BEZ235 10μM。（D）谷氨酰胺消耗的时间进程Tsc2−/−MEF与或不与20ng/mL雷帕霉素孵育24小时。每个时间数据点是三次重复实验的平均值。（F）细胞内谷氨酰胺水平Tsc2型雷帕霉素处理−/−MEF 24小时。（G）谷氨酰胺通量Tsc2型−/−表达空载体（EV）或用所示化合物处理24h后再表达TSC2的MEF。化合物的浓度为：雷帕霉素20ng/mL；LY294002 20μM、BEZ235 10μM、BPTES 10μM和DON 1mM。显示平均值；误差条表示至少三个生物复制品的SEM。免疫印迹图像下方的数字表示根据负荷控制标准化的量化。另请参见图S1。
图2
图2。mTORC1途径通过Myc调节GLS1
（A-C）全细胞裂解液中GLS和Myc蛋白水平：（A）转染非靶向对照siRNA（NTC）或四个独立的抗Myc siRNA 72小时的BxPC3细胞；（B） Tsc2型WT和Tsc2型雷帕霉素20ng/mL处理−/−MEF 8h；（C） Tsc2型稳定表达Myc或空载体（EV）的−/−MEF，用雷帕霉素20ng/mL处理24h。
图3
图3。mTORC1底物S6K1通过Myc mRNA翻译控制GLS
（A）归一化荧光素酶光单位Tsc2型−/−稳定表达Myc-responsive萤火虫荧光素酶结构体（Myc-Luc）或载体控制（pCignal Lenti-TRE Reporter）的MEF。雷帕霉素20ng/mL或PF4708671 10μM处理8h后测定Myc转录活性。（B）表达HA-S6K1-CA（F5A-R3A-T389E）的HEK293T细胞或用雷帕霉素20ng/mL处理24小时的空载体（EV）的全细胞裂解物中的GLS和Myc蛋白水平。（C-D）细胞内谷氨酰胺水平Tsc2型−/−MEF：（C）稳定表达S6KCA（F5A/R5A/T389E；将三种精氨酸或RSPRR基序中的所有残基突变为丙氨酸，效果相同）[10]或空载体，用雷帕霉素20ng/mL或二甲基亚砜处理48小时；（D）转染非靶向对照siRNA（NTC）或抗S6K1/2的siRNA。转染24h后，用PF4708671 10μM或DMSO处理转染NTC siRNA的细胞48h。（E）谷氨酰胺消耗Tsc2型转染非靶向对照siRNA（NTC）或针对S6K1/2的siRNA的−/−MEF。转染72h后，收集培养基，测定培养基中谷氨酰胺的含量。（F）归一化荧光素酶光单位Tsc2型在肾素荧光素酶的控制下，用含有Myc 5'UTR的pDLN报告子构建物转染WT MEFs。萤火虫荧光素酶用作内部控制。转染48小时后，用雷帕霉素20ng/mL或PF4708671 10μM处理细胞8小时。（G）的相对水平Myc公司,Gls公司和肌动蛋白mRNA在每个多体梯度部分。用qPCR测定mRNA水平，并将其归一化为5S rRNA水平。用雷帕霉素20ng/mL处理HEK293T细胞24h，在蔗糖密度梯度上分离多聚体。（H-I）来自以下来源的全细胞裂解物中的GLS和Myc蛋白水平：（H） Tsc2型转染非靶向对照siRNA（NTC）或针对eIF4B的两个独立siRNA 72小时的−/−MEF；（I） Tsc2型稳定表达eIF4B WT、突变S422D或空载体（EV）的−/−MEF，并用雷帕霉素处理24h。显示平均值；误差条表示至少三个生物复制品的SEM。星号（*）表示非特定带。免疫印迹图像下方的数字表示根据负荷控制标准化的量化。另请参见图S2和S3。
图4
图4。抑制GLS降低胰腺癌细胞的生长
（A）雷帕霉素20ng/mL或BEZ235 1μM处理24小时后，BxPC3、MIAPaCa-2或AsPC-1细胞的全细胞裂解液中GLS和Myc蛋白水平。（B）电镀48小时后BxPC3或AsPC-1细胞的谷氨酰胺消耗。（C-D）软琼脂分析：（C）经BPTES（10μM）处理的BxPC3或AsPC-1细胞，以及经BPTES+OAA（2mM）联合处理的细胞；（D）用BPTES处理的BxPC3或AsPC-1细胞，以及BPTES（10μM）+NAC（10mM）的组合。显示平均值；误差条表示至少三个生物复制品的SEM。
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参考文献

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