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.2014年7月21日：5451。
doi:10.1038/ncomms5451。

GIV/Girdin是肝纤维化期间促纤维化信号网络的中心枢纽

洛佩斯·桑切斯 1, 英敦克尔 1, 尹世洛（Yoon-Seok Roh） 1, 亚什·米塔尔 1, 萨缪尔·德米尼奇 1, 安德烈亚·穆兰伊 2, 沙利尼·辛格 2, 坎达维尔·尚穆甘 2, Nakon Aroonsakool公司 1, 菲奥娜·莫莉 1, 塞缪尔·B·何 三, Ekihiro Seki先生 1, 大卫·A·布伦纳 1, Pradipta Ghosh公司 1
附属公司

GIV/Girdin是肝纤维化期间促纤维化信号网络的中心枢纽

Inmacada Lopez-Sanchez公司等人。 国家公社. .

摘要

进行性肝纤维化的特征是活化的肝星状细胞（HSC）沉积胶原。HSC的激活是一个多受体驱动的过程，在这个过程中，纤维前信号被增强，抗纤维途径被抑制。在这里，我们报道了一个由G蛋白亚单位、Gαi和GIV及其鸟嘌呤交换因子（GEF）组成的信号转导平台的发现，该平台在由不同类别的受体启动的纤维生成信号转导网络中充当中心枢纽。GIV在肝纤维化损伤后表达，是HSC活化所必需的。GIV一旦表达，就会增强纤维化前体（PI3K-Akt-FoxO1和TGFβ-SMAD）并抑制抗纤维化（cAMP-PKA-pCREB）通路，从而扭曲信号网络，促进纤维化，所有这些都是通过激活Gαi实现的。我们还提供证据表明，GIV可能是肝损伤后纤维化进展的生物标志物，也是阻止和/或逆转肝纤维化期间HSC活化的治疗靶点。

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数字

图1
图1。慢性纤维源性损伤后肝脏GIV表达增加
(A类)采用半定量PCR（顶部）和定量PCR（底部）分析正常人和HCV感染不同程度纤维化患者肝脏中的GIV mRNA水平。显示了半定量PCR的代表性结果和显示GIV mRNA的折叠诱导的散点图。水平条=平均值。n=动物数量。(B、 C类)分析BDL或假手术小鼠肝脏中GIV mRNA的水平(B类)或慢性注射CCl4或车辆控制(C类)按中的qPCRA类结果显示，与假手术和车辆治疗对照组相比，折叠变化。误差线表示平均值±S.D.n=动物数量。采用双尾Student t检验评估统计显著性。(D、 E类)BDL或假手术小鼠的总肝裂解物(D类)慢性注射CCl4或车辆控制(E类)通过免疫印迹（IB）分析全长GIV、磷酸化Akt（pAkt）和总Akt（tAkt）。(F类)BDL或CCl小鼠的FFPE肝切片4通过IHC分析损伤及其各自对照组的全长GIV蛋白（CT-Ab）的表达。顶部面板中的方框区域在底部面板中被放大。放大倍数=10倍。(G公司)对正常受试者或各种慢性肝损伤患者的FFPE肝切片进行GIV分析E类图像代表了每类中分析的4-11个肝脏。顶部面板中的方框区域在底部面板中被放大。放大倍数=10倍。
图2
图2。HSC损伤后全长GIV mRNA和蛋白表达增加
(A类)通过RT-PCR分析BDL或假手术小鼠肝脏的分离细胞组分的GIV和GAPDH mRNA水平。(B、 C类)从接受BDL或假手术的小鼠肝脏中分离出的原代HSC(B类)或注射CCl4或车辆控制(C类)通过qPCR分析GIV mRNA。结果显示，与假手术和车辆治疗对照组相比，折叠变化。误差线表示平均值±S.D.n=动物数量。采用双尾Student t检验评估统计显著性。(D类)注射CCl慢性治疗的Col-GFP小鼠半薄肝切片4对GIV（红色）、胶原（GFP，绿色）、α-SMA（紫色）和DAPI/DNA（蓝色）或载体对照进行染色，并通过共聚焦显微镜进行分析。箭头=α-SMA pos、Col pos、GIV pos（即HSC）；恒星=α-SMA阴性，GIV阳性，可能是KC和正弦EC。比例尺=10μm。
图3
图3。在培养激活的HSC中，GIV mRNA和蛋白的表达先于激活和胶原的生成
(A类)从Col-GFP小鼠肝脏分离的原代HSC在无涂层塑料皿中培养活化7天。在不同时间点固定细胞，并对GIV（红色）和DAPI/DNA（蓝色）进行染色。GFP信号作为替代标记物检测胶原生成。显示了不同日期的典型图像。比例尺=10μm。(B-E公司)从Col-GFP小鼠肝脏分离的原代HSC在无涂层塑料皿中培养活化7天。GIV公司(B类)、胶原蛋白(C类)和α-SMA(D类)在不同时间点用qPCR检测mRNA水平。(E类)GIV、胶原和α-SMA在B-D公司绘制为相互重叠的线图。GIV表达先于α-SMA和胶原的峰值表达。结果显示为与第0天相比每个目标转录本的折叠变化。
图4
图4。GIV是HSC肌动蛋白重塑、增殖、迁移、存活和胶原生成所必需的
(A类)用对照（Scr）或G cvcIV siRNA处理Lx2细胞，通过免疫印迹（IB）分析裂解产物中的GIV缺失。(B类)将对照组（Scr）和GIV siRNA处理的Lx2细胞固定并染色，以检测Phalloidin（红色）和DAPI/DNA（蓝色），并通过共焦显微镜观察。比例尺=20μm。(C类)对照组（Scr）或GIV siRNA处理的Lx2细胞通过伤口区域的连续成像分析其迁移和闭合划痕的能力（参见补充图3B). 结果表示为伤口闭合百分比。(D、 E类)Lx2细胞，如C类通过免疫荧光和共焦显微镜（参见补充图3C、D). 结果以染色阳性细胞百分比表示。(F、 G公司)对对照（Scr）或GIV siRNA处理的Lx2细胞进行BAX分析(F类)和Bcl-2(G公司)qPCR检测mRNA。结果显示为与各自的Scr处理控件相比的折叠变化。(H、 我)分析对照组（Scr）或GIV siRNA处理的Lx2细胞裂解的Caspase 3(我)免疫荧光和DNA片段TUNEL染色(H（H）). 条形图显示Y轴上Caspase 3（I）裂解或DNA片段（H；TUNEL）的%细胞。(J型)Lx2细胞用对照（Scr）或GIV siRNA处理，或用siRNA抗性的GIV-WT或GIV-FA转染，如图所示，饥饿，随后用TGF-β1处理。通过qPCR测定胶原α1 mRNA，结果显示为与饥饿对照组（Y轴）相比的折叠变化。(K、 L（左）)用表达HA标记的GIV-WT或GIV-FA的腺病毒感染原代小鼠HSC，饥饿，然后用TGF-β1治疗(我)或PDGF-BB(J型). 用qPCR检测胶原α1 mRNA水平。结果显示为与饥饿控件（Y轴）相比的折叠变化(我)用磷酸氢istone H3分析有丝分裂指数(J型)如中所示D类结果显示为核磷蛋白H3阳性细胞百分比（Y轴）。误差线表示平均值±S.D.n=3。采用双尾Student t检验评估统计显著性。
图5
图5。PDGFRβ在肝损伤过程中直接结合并磷酸化HSC中的GIV
(A、 B类)PDGF-BB刺激Lx2细胞的全细胞裂解物(A类)或使用TGF-β1(B类)通过免疫印迹（IB）分析各种信号通路。(C类)用抗PDGFR或对照IgG对血清饥饿或PDGF-BB处理的Lx2细胞的裂解物（右侧）进行免疫沉淀。通过免疫印迹（IB）分析结合免疫复合物（左）的GIV、总（t）和活化（pY716）PDGFR、p85α（PI3K）和Gαi3。M=饥饿和刺激Lx2裂解物的混合物。(D类)GST-PDGFR在体外自磷酸化，并用于纯化的His-GIV CT或His-PCT（Podocalyxin Tail；阴性对照）的下拉分析。用磷酸化-Tyr（pTyr）抗体通过免疫印迹（IB）观察结合受体。Ponceau S染色证实了等量的His标记配体。(E类)利用重组PDGFR对野生型（WT）和His-GIV CT的磷酸化突变体进行体外激酶检测。通过免疫印迹（IB）分析pTyr和His-GIV-CT的反应。合并面板中的黄色像素（pTyr和His）显示磷酸化GIV-CT(F类)固定Col-GFP小鼠培养激活的原代HSC，并对其进行活性pY1764GIV（红色）和活性pY716PDGFR（青色）染色。“合并”面板显示PM处红色和青色像素的同位化（箭头）。箭头=质膜。比例尺=25μm。(G公司)用PDGF-BB刺激Lx2细胞，固定并染色pY1764GIV（红色）、活性pY716PDGFR（绿色）和DAPI/DNA（蓝色）。“合并”面板显示黄色像素，表示PM的同位化（箭头）。箭头=质膜。比例尺=10μm。(H（H）)固定培养物激活的原代HSC，并对活性pY1764GIV（红色）和DAPI/DNA（蓝色）进行染色。GFP信号检测胶原生成。比例尺=10μm。F类,G公司和H（H）共聚焦显微镜分析。(我)左：BDL或CCl小鼠的肝脏切片4通过IHC分析损伤后的pY1764GIV活性。左侧面板上的方框区域在右侧放大。右：两种实验模型的相应对照组均未观察到染色。放大倍数=10倍。
图6
图6。GIV的GEF功能增强HSC中促纤维化Akt和SMAD信号
(A类)通过免疫印迹（IB）分析表达GIV突变体的Lx2细胞的全细胞裂解物的各种信号通路。(B-D公司)用对照（Scr）或GIV siRNA处理的Lx2细胞转染抗siRNA的GIV-WT或指示的突变体，饥饿（0%FBS），然后在裂解前用血清或各种配体刺激。通过免疫印迹（IB）分析等等分的裂解物中的GIV、磷酸化Akt和总Akt。(E-F公司)将感染GIV-WT-HA或GIV-FA-HA腺病毒的Lx2细胞保存在0.2%的FBS中，固定并染色HA（GIV，绿色）、FoxO1（红色）和DAPI/DNA（蓝色），并用共焦显微镜进行分析。恒星=核FoxO1。比例尺=10μm。结果显示FoxO1核细胞百分比（Y轴）(F类). (G、 H（H）)去除内源性GIV的Lx2细胞随后被转染各种GIV构建物，并对这些细胞提取的RNA进行Bcl-2分析(G公司)和BAX(H（H）)通过qPCR检测mRNA水平。(一、 J型)Lx2细胞感染GIV-WT-HA或GIV-FA-HA腺病毒，保存在0%的FBS中，固定并分析裂解的Caspase 3(J型)免疫荧光法和TUNEL染色法检测DNA片段(我). 条形图显示Y轴上Caspase 3（J）裂解或DNA片段（I；TUNEL）的%细胞。(K)去除内源性GIV的Lx2细胞随后转染siRNA-resistant GIV-WT或GIV-FA，用TGFβ和磷酸化SMAD刺激，并用免疫印迹（IB）分析总（t）SMAD 2/3。根据带密度测定法，表达GIV-WT的细胞中pSMAD/tSMAD的比率比表达GIV-FA的细胞高约2.0倍。(五十、 M（M）)将感染GIV-WT-HA或GIV-FA-HA腺病毒的Lx2细胞保存在0.2%的FBS中，固定并染色HA（GIV，绿色）、SMAD2/3（红色）和DAPI/DNA（蓝色），并用共聚焦显微镜进行分析。星形=核SMAD2/3。比例尺=10μm。(M（M）)条形图显示核tSMAD2/3英寸的%细胞K误差线表示平均值±S.D.n=3。采用双尾Student t检验评估统计显著性。
图7
图7。GIV激活Gαi并抑制HSC中抗纤维化cAMP/PKA/pCREB信号
(A类)Lx2细胞的裂解物被用作下拉分析中全长GIV的来源，GST或GST-Gαi3单独预加载GDP（非活性）或AlF−4（活性），并固定在谷胱甘肽珠上。通过免疫印迹（IB）分析结合的GIV和Gβγ。Ponceau S染色显示GST蛋白。(B类)在裂解之前，用多种配体刺激缺乏血清的Lx2细胞。用Gαi:GTP单克隆抗体对等分的裂解物进行免疫沉淀，该单克隆抗体识别G蛋白的活性构象，并通过免疫印迹（IB）分析Gαi3的免疫复合物。(C类)用对照（Scr）或GIV siRNA处理的Lx2细胞用抗siRNA的GIV-WT或GIV-FA转染，并保持在0.2%的FBS中B类. (D类)在裂解前用PDGF-BB刺激转染GIV-WT或GIV-FA的Lx2细胞。通过RIA分析裂解液中的cAMP，并将其归一化为总蛋白。结果显示为cAMP（Y轴）中的折叠变化。(E类)通过免疫印迹法（IB）分析转染GIV-WT或GIV-FA的Lx2细胞的GIV、phospho（p）Akt、phosphate（p）CREB和tubulin。根据带密度测定法，表达GIV-FA的细胞中pCREB/微管蛋白的比率比表达GIV-WT的细胞高约2.5倍。(F类)将感染GIV-WT-HA或GIV-FA-HA腺病毒的Lx2细胞保存在0.2%的FBS中，固定并染色HA（GIV，绿色）、磷酸（p）CREB（红色）和DAPI/DNA（蓝色），并用共聚焦显微镜进行分析。箭头=GIV表达细胞。星=核反应堆。比例尺=10μm。结果显示%的细胞核pCREB细胞（Y轴）(G公司). 误差线表示平均值±S.D.n=3。采用双尾Student t检验评估统计显著性。
图8
图8。GIV增强HSC中的促纤维化和抑制抗纤维化信号通路
不同类别纤维原性受体（顶部）的配体刺激通过直接相互作用（实心箭头）或未知机制（间断箭头）聚合到GIV上，以增强PI3K-Akt信号（1）并激活三聚体Gαi（2）。依赖于GIV的Akt激活引发了几种非转录反应（3），导致HSC激活。GIV-PI3K-Akt途径还调节两种不同的转录程序——（i）通过增加SMAD2/3（4）的磷酸化及其向细胞核的移位来增强纤维化前TGFβ-SMAD途径（5），从而增强胶原蛋白和α-SMA的增殖和转录（6）；（ii）通过磷酸化（7）抑制转录因子Foxo1，并触发其在细胞核外的移位（8），从而拮抗Foxo 1在生理学上维持的抗纤维化程序（9）。通过GIV的GEF功能激活Gi（2）抑制cAMP（10）的生成，cAMP是HSC中的一条主要抗纤维化途径，因为其能够抑制HSC迁移和增殖（11）。已知cAMP-PKA途径通过磷酸化CREB（12）在转录水平抑制纤维化，CREB转位到细胞核并抑制胶原蛋白和α-SMA的转录（13）。原发性途径=蓝色；抗纤维化=红色。
图9
图9。肝活检中GIV的表达可能预测纤维化进展
(A类)通过IHC分析正常受试者和HCV感染患者不同纤维化阶段肝活检中GIV的表达。染色由两名病理学家使用简单的二进制评分系统对纤维化程度进行评分；即GIV为正或负。结果显示为每类纤维化中GIV（Y轴）阳性患者的%。(B类)来自的代表性IHC图像A类显示了不同类型纤维化中阳性和阴性染色的肝脏样品的例子。放大倍数=10倍。(C、 D类)根据FIB-4的测定，线形图描述了无纤维化或轻度纤维化患者的纤维化进展(C类)和APRI(D类)根据肝活检时和3年随访时的临床参数得出的评分。p值表明3年时纤维化评分存在显著差异(E类)示意图显示了我们提出的GIV在肝纤维化期间HSC纤维化信号传导中的作用模型。自上而下：各种类型的纤维损伤导致不同类别的受体激活，从而触发HSC中GIV的上调。GIV增加通过调节两条关键信号通路触发静止HSC转化为激活的肌成纤维细胞：1）原纤维PI3-KAkt通路和2）抗纤维cAMP-PKA通路。在静止的HSC中，低水平GIV表达产生一个净抗纤维化信号程序，其特征是Akt活性低，Gαi激活受损，从而导致cAMP水平升高。在活化的HSC中，高水平GIV表达产生一个净促纤维化信号程序，其特征是Akt活性高，Gαi活化增加，cAMP水平低。低GIV表达使HSC保持静止状态，触发细胞凋亡，抑制正常肝脏中的胶原生成，而高GIV表达增强HSC迁移、增殖和存活，并触发胶原生成，从而导致肝纤维化。n=患者人数。误差条代表平均值±标准偏差。采用双尾Student t检验评估统计显著性。
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