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.2014年6月12日；510(7504):298-302.
doi:10.1038/nature13236。 Epub 2014年5月4日。

定量通量分析揭示叶酸依赖性NADPH的产生

京凡 1, 叶江滨 2, Jurre J Kamphorst法官 三, 托梅·什洛米 4, 克雷格·B·汤普森 5, 约书亚·D·拉比诺维茨 三
附属公司

定量通量分析揭示了依赖于叶酸的NADPH生成

京凡等。 自然. .

中的勘误表

  • 自然。2014年9月25日；513(7519):574

摘要

ATP是动物机械和电气工作（例如肌肉收缩或神经元放电）的主要能量来源。对于化学工作，NADPH具有同样重要的作用，它为氧化还原防御和还原生物合成提供动力。从葡萄糖生成NADPH的最直接途径是氧化戊糖磷酸途径，苹果酸酶有时也很重要。虽然已经广泛分析了糖酵解和氧化磷酸化对ATP生成的相对贡献，但缺乏对NADPH代谢的类似分析。在这里，我们证明了通过液相色谱-质谱法直接跟踪氘从标记底物进入NADPH的能力，并将这种方法与碳标记和数学建模相结合，以测量NADPH通量。在增殖细胞中，细胞溶质NADPH的最大贡献者是氧化戊糖磷酸途径。令人惊讶的是，丝氨酸驱动的单碳代谢的贡献几乎相当，其中亚甲基四氢叶酸氧化为10-甲酰基四氢叶酸酯与NADP（+）还原为NADPH耦合。此外，线粒体单碳代谢的追踪显示10-甲酰四氢叶酸完全氧化生成NADPH。由于叶酸代谢以前不被认为是NADPH的产生者，因此通过敲除亚甲基四氢叶酸脱氢酶（MTHFD）基因来确认其功能重要性。细胞溶质或线粒体MTHFD同工酶的耗竭导致细胞NADPH/NADP（+）降低，谷胱甘肽比值（GSH/GSSG）降低，细胞对氧化应激的敏感性增加。因此，尽管叶酸代谢对增殖细胞的重要性早已被认识到，并归因于其为核酸合成产生一个碳单位的功能，但该途径的另一个关键功能是产生还原力。

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数字

扩展图1
扩展图1。使用以下方法探讨oxPPP对NADPH生成的部分贡献2H-葡萄糖
（a） NADPH和NADP的M+0和M+1形式的LC-MS色谱图示例+。绘制的值是每个化合物周围的5 ppm质量窗口。（b） NADPH标记的范围必须根据葡萄糖-6-磷酸标记的范围进行校正。糖原流入或H/D交换可能导致标记不完整。（c） iBMK细胞中葡萄糖-6-磷酸和果糖-1,6-磷酸的标记分数，有和没有活化的Akt（转换为1-2H-葡萄糖）。（d） 喂食后1,6-磷酸果糖和6-磷酸葡萄糖酸的标记分数1-2H-葡萄糖。果糖-1,6-磷酸的标记分数反映了葡萄糖-6-磷酸的标记，在添加2在HEK293T和MDA-MB-468细胞中，H-葡萄糖与其他LC-MS峰的分离度不够，无法直接对其标记进行精确定量。葡萄糖-6-磷酸和6-磷酸葡萄糖酸之间标记分数的差异反映了氘标记分数特别是在葡萄糖-6-磷酸酯的位置1。（e） 由于动力学同位素效应，氘示踪剂的注入可能会改变路径通量。评估1-2葡萄糖在oxPPP中造成瓶颈，我们测量了添加或不添加1-2H-葡萄糖。未观察到明显变化。（f） 氘动力同位素效应的不同校正机制对oxPPP对NADPH生成的分数贡献的影响。（g） 氘动力同位素效应的不同校正机制对计算的NADPH总生成率的影响。校正机制是（i）无动力同位素效应（CKIE公司=1），（ii）对总途径通量没有影响，但优先利用1H超过2H标记底物（正文中的等式4）（最小的合理校正，正文中应用的校正），或（iii）分离酶观察到的全动力学同位素效应，伴随着总途径通量的减少（方法中的等号M5）（最大的合理校正）。所有结果均为单个实验的平均值±SD，N≥2个生物重复，并在多个实验中得到证实。
扩展图2
扩展图2。两种独立的测量方法给出了一致的oxPPP通量
（a） 第1张图-14C-葡萄糖和6-14通过糖酵解和磷酸戊糖途径进行C-葡萄糖代谢。oxPPP特异性地释放葡萄糖C1作为CO2，而所有其他CO2-释放反应是磷酸三糖异构酶（TPI）的下游。由于TPI使葡萄糖的C1和C6无法区分（这两个位置都成为3-磷酸甘油醛的C3），CO的差异2C1与C6的释放量乘以2，得出通过oxPPP产生NADPH的绝对速率。一个潜在的并发症是通过非氧化PPP的反应进行碳扰民，但这并不重要（参见扩展图3）。（b） 葡萄糖-6-磷酸的完整碳标记。葡萄糖-6-磷酸在细胞转换为U型细胞后2小时内完全标记（>99%）-13C-葡萄糖。（c） 合作2释放速率从1开始-14C-葡萄糖和6-14C-葡萄糖。（d） 6-磷酸葡萄糖酸盐的池大小。（e） 葡萄糖-6-磷酸和6-磷酸葡萄糖酸盐标记细胞到U的动力学-13C-葡萄糖。（f） 基于最符合标记动力学（蓝色）的通量（见方法），在模拟标记曲线（e）的6-磷酸葡萄糖酸盐数据上叠加14C-CO公司2释放测量值（绿色）。（g） 基于U标记6-磷酸葡萄糖酸盐动力学的计算通量和95%置信区间-13C-葡萄糖，与放射性CO相比2从1释放-14C-葡萄糖和6-14C-葡萄糖。这两种方法给出了一致的结果14C-CO公司2更准确地发布数据。平均值±标准差，N=3。
扩展图3
扩展图3。通过非oxPPP的碳扰动程度不足以影响使用1确定oxPPP通量-14C和6-14C-葡萄糖，大多数碳进入oxPPP，用于核苷酸合成
（a） 糖酵解和PPP示意图显示葡萄糖C6的去向。请注意，葡萄糖C6在每个中间体中占据磷酸化位置（即最后一个碳）。因此，在分解代谢为丙酮酸时，葡萄糖C6始终成为丙酮酸C3，而不考虑任何潜在的干扰反应。（b） 糖酵解和PPP示意图显示葡萄糖C1的去向。葡萄糖C1可以通过非oxPPP搅动，移动到C3（红色方框）或C6，如图所示。绿色方框中显示的形状没有实验观察到。当葡萄糖C3变成丙酮酸C1（丙酮酸的羧酸碳）时，其选择性地释放为CO2通过丙酮酸脱氢酶，C1到C3的混乱可能会增加CO2葡萄糖C1相对于C6的释放。这在面板（d）和（e）中被排除。（c） 喂食1-13C-葡萄糖或6-13C-葡萄糖导致50%的3-磷酸甘油酯标记，而没有任何双重标记（即M+2），正如在没有干扰的情况下所预期的那样。（d） MS/MS方法分析1-标记丙酮酸盐的位置标记。碰撞诱导的离解破坏丙酮酸，释放羧酸基团作为CO2如果1-标记丙酮酸的子峰不包含标记碳（M/z=43），则标记位于C1位置；否则，它位于C2或C3。（e） 喂食1后-13C-葡萄糖或6-13C-葡萄糖、丙酮酸在C1位置没有标记（<0.5%），排除了大量干扰。（f） OxPPP通量类似于或小于核苷酸合成的核糖需求。平均值±SD，N=3。
扩展图4
扩展图4。探讨NADPH替代生成途径的作用
（a） 显示2,3,3,4,4潜力的路径图-2谷氨酰胺通过谷氨酸脱氢酶和苹果酸酶标记NADPH。标记的氢以红色显示。（b）NADP+和NADPH标记模式（不校正自然13C丰度）与2,3,3,4,4孵育48小时后-2H-谷氨酰胺。NADP的不可区分标记+NADPH意味着缺乏NADPH氧化还原活性氢标记。（c） 显示2,3,3电位的路径图-2H-天冬氨酸通过异柠檬酸脱氢酶标记NADPH。（d） NADP公司+和NADPH标记模式（不校正自然13C丰度）与2,3,3孵育48小时后-2H-天冬氨酸。NADP的不可区分标记+NADPH意味着缺乏氧化还原活性氢标记。（e） 2,3,3,4,4示意图-2H-谷氨酰胺通过TCA循环代谢，追踪标记氢。颜色较浅的氢原子表示与水的潜在H/D交换。（f） 给细胞喂食2,3,3,4,4后的苹果酸标记分数-2H-谷氨酰胺48小时（g）显示1,2,3电位的路径图-13C-苹果酸（通过喂食U制成-13C-谷氨酰胺）通过苹果酸酶标记丙酮酸盐和乳酸盐。（h） 苹果酸和丙酮酸/乳酸的含量13C标签。用U培养细胞-13C-谷氨酰胺作用48小时后，M+3丙酮酸表示苹果酸酶通量，可能产生NADH或NADPH。对于M+3乳酸，也获得了类似的结果，在乳酸检测结果较好的情况下，它被用作丙酮酸的替代物。相应的最大可能苹果酸酶驱动NADPH生成速率范围，取决于细胞系，从<2 nmolμL-1小时-1至6 nmolμL-1小时-1平均值±SD，N≥2。
扩展图5
扩展图5。依赖THF的NADPH生成的计算和实验证据
（a） 基于通量平衡分析，以总通量最小化为目标函数，预测不同生物量组成中叶酸代谢对NADPH生成的贡献。由蛋白质、核酸和脂质组成的细胞干重的生物量分数变化如下：蛋白质50%-90%，步长为10%；RNA/DNA 3%-20%，步长为1%，脂质3%-20%（仅考虑总和不超过100%的组合）。根据这一生理上可能的生物量组成范围，该模型预测叶酸代谢的中位贡献为24%。注意，在实验测量的生物量组成的限制下，但在不限制谷氨酰胺以外氨基酸的摄取率≤谷氨酰胺摄取率的1/3的情况下，叶酸途径对总NADPH生成的贡献预计为23%。（b） 在最大增长率约束下，通过通量变异性分析计算Recon1模型中NADPH生成反应的可行通量范围。如图所示，该模型预测，理论上每个产生NADPH的反应都可以具有零通量，所有NADPH的产生都通过替代途径进行。只显示通量上限大于零的反应。通过热力学上不可行的无效循环产生NADPH的反应被手动移除。如图所示，在所有产生NADPH的反应中，MTHFD具有与最大生长相一致的最高通量。（c） 显示2,3,3电位的路径图-2H–丝氨酸通过亚甲基四氢叶酸脱氢酶标记NADPH。（d） NADP公司+与2,3,3孵育48小时后的NADPH标记模式-2H-丝氨酸（培养基中没有甘氨酸）。与NADP相比，更多重标记形式的NADPH的丰度更高+表示氧化还原活性氢标记。结果为单个实验的平均值±SD，N≥2个生物复制品，并在N≥2次实验中得到证实。根据面板（d）中的数据，MTHFD1对细胞溶质NADPH生成的贡献范围很广（占细胞溶质总NADPH的10%-40%；该范围是由于细胞系间的差异、实验噪声和较大的KIE所致）。该范围包括基于嘌呤生物合成速率和14C-CO公司2丝氨酸释放（图3d）。请注意，细胞溶质叶酸代谢对NADPH生成的总贡献可能超过MTHFD1，因为10-甲酰-THF脱氢酶也会生成NADPH。
扩展图6
扩展图6。用于嘌呤和胸苷合成的一碳单元来自丝氨酸
（a） HEK293T细胞与U孵育24小时后的丝氨酸和ATP标记模式-13C-丝氨酸。M+1到M+4 ATP的存在表明丝氨酸通过甘氨酸和丝氨酸C3衍生的单碳单元为嘌呤提供碳。（b） 定量分析细胞内ATP、甘氨酸和丝氨酸标记的胞浆单碳单位标记结果表明，大多数被嘌呤吸收的胞浆10-甲酰-THF来自丝氨酸。（c） U型-13丝氨酸标记了区分dTTP和dUTP的甲基。（d） U型-13C-甘氨酸不标记dTTP。（e） dTTP标记的范围反映了细胞内丝氨酸标记的范围。（f） 蛋氨酸未从U标记-13C-甘氨酸。在所有实验中，细胞在U-13C丝氨酸或甘氨酸48小时。平均值±SD，N=3。
扩展图7
扩展图7。CO的测量2丝氨酸和甘氨酸的结合释放速率14C-和13C-标签
（a）14C-CO公司2当细胞被注入微量3的培养基时的释放率-14C-丝氨酸，1-14C-甘氨酸或2-14C-甘氨酸。（b） 在含有0.4 mM 3的DMEM培养基中生长的细胞内标记丝氨酸的分数-13C丝氨酸取代未标记的丝氨酸。残留的未标记丝氨酸可能来自从头开始合成。（c） 在含有0.4mM U的DMEM培养基中生长的细胞中标记的细胞内甘氨酸的部分-13C-甘氨酸代替未标记的甘氨酸。（d） CO公司2丝氨酸C3、甘氨酸C1或C2的释放速率。（e） 甘氨酸或丝氨酸代谢为CO的潜在替代途径2，通过丙酮酸。（f） 用U标记48小时后的丙酮酸标记分数-13C丝氨酸或U-13C-甘氨酸。丙酮酸缺乏标记表明丝氨酸和甘氨酸不是通过这一途径代谢的。（g） MTHFD2或ALDH1L2的敲除降低CO2甘氨酸C2释放。（h） 敲除ALDH1L2会降低GSH/GSSG比率。平均值±SD，N=3。
扩展图8
扩展图8。在没有丝氨酸的情况下，升高浓度的甘氨酸抑制细胞生长并降低NADPH/NADP+比率
（a） 丝氨酸羟甲基转移酶反应示意图。高甘氨酸可能抑制正向通量（产品抑制）或驱动储备通量。（b） HEK293T细胞在常规DMEM、无丝氨酸DMEM和无丝氨酸的DMEM中培养3天后的相对细胞数，是正常甘氨酸浓度的12.5倍（5 mM而不是0.4 mM）。（c） 相对NADPH/NADP+将HEK293T细胞在常规DMEM、无丝氨酸DMEM和无丝氨酸的DMEM中培养3天后的比率（归一化为DMEM培养的细胞）以及正常甘氨酸浓度的12.5倍。（d） （e）喂饲U后丝氨酸和甘氨酸的标记-13C丝氨酸或U-13C-甘氨酸显示反向丝氨酸羟甲基转移酶通量。平均值±SD，N=3。
扩展图9
扩展图9。生物质生产和抗氧化防御中NADPH消耗的定量分析
（a） 细胞倍增时间，与生物产量成反比。（b） 细胞蛋白质含量。（c） 细胞脂肪酸含量（来自细胞总脂质的皂化）。（d） 脂肪酸合成与进口的定量，合成但进口不需要NADPH。HEK293T细胞在U-13C-葡萄糖和U-13C-谷氨酰胺直至假稳定状态，从总细胞脂质中皂化的脂肪酸及其标记模式（绿色条），以及每种脂肪酸的生产与进口，均基于此实验数据进行了模拟。通过最小二乘拟合确定每条路线的分数贡献，理论标记模式基于所示的阐明路线（粉色条）。MD-MBA-468、iBMK-亲代和iBMK-Akt细胞（未显示）也获得了类似数据，并用于计算脂肪酸合成相关NADPH消耗量。（e） 细胞DNA和RNA含量。（f） NADPH消耗量从头开始DNA合成。（g） 尿液中24小时后的脯氨酸和谷氨酸标记模式-13C-谷氨酰胺培养基，用于定量不同脯氨酸合成途径和相关NADPH消耗。（h） 氧化应激（150μM h）下正常生长的HEK293T细胞（对照）和非生长细胞中NADPH消耗的定量分析2哦2，5小时）。根据oxPPP绝对通量除以oxPPP对总NADPH的部分贡献，测量细胞内NADPH总周转量2从1形成H-2H-葡萄糖。平均值±SD，N=3。
扩展图10
扩展图10。通过western blot或Q-PCR确认敲除效率
（a） G6PD击倒的Western blot。（b） MTHFD1和MTHFD2敲除的Western blot。（c） ME1敲除的mRNA水平。（d） NNT敲除的mRNA水平。（e） IDH1和IDH2敲除的Western blot。（f） ALDH1L2敲除蛋白印迹。（g） HEK293T的细胞倍增时间，指示基因稳定敲除（同一基因不同发夹的结果无法区分）。
图1
图1
通过oxPPP定量NADPH标记和总细胞溶质NADPH生成。（a） OxPPP途径示意图。（b） NADPH和NADP的质谱+来自标记为1的单元格-2H-葡萄糖（iBMK-亲代细胞，20分钟）。（c） NADPH标记动力学-2H-葡萄糖（iBMK-亲代细胞）。（d） NADPH标签来自1-2H-葡萄糖（20分钟）。（e） 1个-2H-葡萄糖和3-2H-葡萄糖产生类似NADPH标记（iBMK-亲代细胞，20分钟）。葡萄糖-6-磷酸1的底物标记-2H-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖酸盐3-2H-葡萄糖。（f） 图示细胞溶质NADP总量+还原通量是绝对oxPPP通量（根据14C-CO公司2排泄）除以部分oxPPP贡献（基于NADPH测量2H标签）。（g） 基于差异的OxPPP通量14C-CO公司2从1释放-14C-和6-14C-葡萄糖。（h） 总细胞溶质NADP+还原通量。所有结果均为单个实验的平均值±SD，N≥2个生物重复，并在多个实验中得到证实。
图2
图2
促进NADPH生成的途径。（a） 典型NADPH生产途径。（b） NADPH和NADP+与2,3,3,4,4孵育后的同位素分布（不校正天然同位素丰度）-2H-谷氨酰胺示踪剂，通过谷氨酸脱氢酶和苹果酸酶探测NADPH的产生（HEK293T细胞，20分钟）。另请参见扩展图4。（c） NADPH和NADP+同位素分布as in（b）使用2,3,3-2H–天冬氨酸示踪剂，通过IDH探测NADPH的产生。另请参见扩展图4。（d） 通过实验限制的基因组尺度通量平衡分析预测NADPH生产路线。（e） NADPH和NADP+同位素分布as in（b）使用2,3,3-2通过叶酸代谢（培养基中没有甘氨酸）探测NADPH生成的H-丝氨酸示踪剂。另请参见扩展图5。（f） 相对NADPH/NADP+HEK293T细胞中各种潜在NADPH生成酶（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）、细胞溶质苹果酸酶（ME1）、细胞溶解和线粒体异柠檬酸脱氢酶（IDH1和IDH2）、转氢酶（NNT）以及细胞溶质和线粒体亚甲基四氢叶酸脱氢酶。绘制的比率与矢量控制击倒有关。结果为单个实验的平均值±SD，N≥2个生物复制品，并在多个实验中得到证实。
图3
图3
叶酸依赖型NADPH生成的定量。（a） 路径示意图，丝氨酸C3为蓝色，甘氨酸C1为红色，甘氨酸C2为绿色。（b） 与U孵育后的甘氨酸和ATP标记模式-13C-甘氨酸（HEK293T细胞，24小时）。M+3和M+4 ATP的缺乏表明没有甘氨酸衍生的单碳单元有助于嘌呤合成。（c） 与2,3,3孵育24小时后，氧化还原活性氢处标记的NADPH分数-2具有稳定MTHFD1或MTHFD2敲除的HEK293T细胞中的H丝氨酸。（f）–（i）中也使用了相同的单元格。（d） 胞浆叶酸依赖性NADPH产生的绝对速率。（e） CO公司2甘氨酸C1和甘氨酸C2的释放速率。（f） GSH/GSSG比率。（g） 暴露于h中48小时期间，相对生长，归一化为未处理样品2哦2.（h）暴露于250μM h 24小时后部分死亡2哦2（i）暴露于300μM二胺24小时后部分死亡。（j） 使用DCFH分析测定相对ROS水平。平均值±SD，N=3。
图4
图4
NADPH生产和消费的比较。（a） 主要NADPH消费途径。（b） 细胞质NADPH生产和消费通量。平均值±标准偏差，误差条显示总生产或消费的变化，N=3。
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