Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells

doi:10.1038/ncb2837

.2013年10月；15(10):1197-1205.

doi:10.1038/ncb2837。 Epub 2013年9月15日。

心磷脂外化到线粒体外膜是神经元细胞有丝分裂的消除信号

附属公司

¹宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学病理学系，邮编15213。
²宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学环境和职业健康系及自由基和抗氧化剂健康中心，邮编15213。
^三宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学危重症护理医学系和萨法尔复苏研究中心，邮编15213。
⁴匹兹堡大学结构生物学系，匹兹堡，PA 15213。
⁵匹兹堡大学计算与系统生物学系，宾夕法尼亚州15213。
⁶宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学细胞生物学和生理学系及生物成像中心，邮编15213。

^#贡献均等。

PMID： 24036476
PMCID公司：项目经理3806088
内政部： 10.1038/ncb2837

心磷脂外化到线粒体外膜是神经元细胞有丝分裂的消除信号

查琳·T·楚等。 Nat细胞生物学. 2013年10月.

.2013年10月；15(10):1197-1205.

doi:10.1038/ncb2837。 Epub 2013年9月15日。

附属公司

¹宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学病理学系，邮编15213。
²宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学环境和职业健康系及自由基和抗氧化剂健康中心，邮编15213。
^三宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学危重症护理医学系和萨法尔复苏研究中心，邮编15213。
⁴宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学结构生物学系，邮编15213。
⁵宾夕法尼亚州匹兹堡大学计算与系统生物学系15213。
⁶宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学细胞生物学和生理学系及生物成像中心，邮编15213。

^#贡献均等。

PMID： 24036476
PMCID公司：项目经理3806088
内政部： 10.1038/ncb2837

摘要

识别损伤的线粒体通过大分子自噬降解对细胞健康至关重要，但其机制仍不清楚。心磷脂是一种线粒体内膜磷脂。我们发现鱼藤酮、星形孢菌素、6-羟基多巴胺和其他促线粒体自噬刺激物导致心磷脂外化到初级皮层神经元和SH-SY5Y细胞的线粒体表面。心磷脂合成酶或磷脂超链反应酶-3（将心磷脂运输至线粒体外膜）的RNAi敲低降低了线粒体向自噬体的传递。此外，我们发现，介导自噬体形成和货物识别的自噬蛋白微管相关蛋白-1轻链3（LC3）含有对自噬系统吞噬线粒体很重要的心磷脂结合位点。通过计算模型预测为心磷脂相互作用位点的LC3残基突变抑制了其参与有丝分裂。这些数据表明，心磷脂的重新分布是一种“吃-米”信号，用于清除神经元细胞受损的线粒体。

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数字

**图1。鱼藤酮诱导的有丝分裂**
鱼藤酮增加SH-SY5Y细胞中GFP-LC3点和与线粒体（箭头）共定位**（a-c）**1μM）和初级皮层神经元**（d）**，250 nM），在图3f和补充图S1b-c中定量。鱼藤酮增加了线粒体绿色染色线粒体向溶酶体溶酶体的输送**（e、f）**被SH-SY5Y细胞中Atg7或LC3的siRNA敲低所抑制。插图：RNAi击倒。鱼藤酮降低原代神经元IMM（COXIV）、OMM（TOM40）和基质（MnSOD）蛋白表达水平**（g）**，被巴非霉素（Baf）逆转-抑制自溶体降解，如补充图S1e所示。b、c的n=7个独立实验和f、g的n=3个独立实验的平均+/-s.d.（见统计源数据表）；*与车辆控制相比p<0.05；†与Rot-siCtrl相比p<0.05。刻度=10μm。关于未截取的斑点，参见补充图S7。

**图2。线粒体CL分布和外化分析**
在所示处理后从原代神经元分离的IMM和OMM组分是提取的脂质，用于LC-MS分析。质谱**（a）**鱼藤酮处理后OMM的CL含量增加，IMM显示7个簇的簇分布多样化。饼图显示了来自中毒神经元的IMM和OMM组分之间的CL分布，标准化为线粒体脂质Pi（b）鱼藤酮治疗导致PLA显著增加₂-LC-MS测定初级皮层神经元中可水解（表面可及）CL（c），250 nM）和SH-SY5Y电池**（d），**1μM）。6-OHDA和CCCP处理增加了SH-SY5Y中Annexin V探测的CL的表面暴露**（e），**120μM）和Parkin表达的HeLa细胞**（f），**20μM）。c-f的n=3个独立实验的平均+/-s.d.（见统计数据源数据表）；*与对照组相比，p<0.05。

**图3。核糖核酸酶RNAi敲低降低CL暴露和有丝分裂**
用Mitotracker Green FM（一种跨膜电位非依赖性染料）染色SH-SY5Y细胞，表达对照组（siCtrl）或超临界RNA#508（siPLS3）×72h，并用鱼藤酮（1μM）处理。通过流式细胞术测定暴露于分离线粒体外表面的阴离子磷脂与Alexa 647-膜联蛋白V的结合**（a）**PLS3敲除对Rot诱导的自噬没有影响**（b）**，但鱼藤酮处理的SH-SY5Y细胞的线粒体自噬减少**（c），**1μM）或6-OHDA（d），120微米）。使用第二个siRNA#433重述siPLS3的作用**（d），**补充图S3b，S3g），并通过转染抗RNAi小鼠PLS3载体进行逆转**（e）**72小时后，用鱼藤酮（250 nM）处理转染了心磷脂合成酶siRNA（siCLS）或打乱siCtrl的原代神经元，并通过共定位分析（f）或线粒体蛋白免疫印迹分析其自噬（补充图S1b）或有丝分裂**（g）**和密度计**（h，i）；**补充图S4c）。拆卸效率如补充图S3和S4所示。n的平均+/−s.d.=b、c的4个独立实验，n=a、df、h-i的3个独立实验（见统计数据源数据表）；*与车辆相比p<0.05；†与经毒性治疗的siCtrl相比，p<0.05；**与Rot-siPLS3相比，p＜0.05。关于未截取的斑点，参见补充图S7。

**图4。Rot、STS或6-OHDA对Beclin 1裂解及Parkin和p62分布的影响**
Western blot分析显示，暴露于丝裂原诱导的亚致死鱼藤酮（250 nM×2h:Rot low）或staurosporine（100 nM×2 h:STS）浓度下的初级神经元中未观察到Beclin 1裂解产物（<49 kDa）**（a）**然而，暴露于致死剂量的鱼藤酮（1 mM×24h：腐烂高）后，Beclin-1被裂解。同样，暴露于鱼藤酮后，SH-SY5Y细胞未显示Beclin 1分裂**（b）**或6-OHDA（c）；重复车道）。数据代表了每种毒素2-3个独立实验。用6-OHDA（120μM）、Rot（1μM）或FCCP（2μM）处理稳定表达PINK1-Flag的SH-SY5Y细胞的细胞裂解液，并用Flag免疫印迹分析PINK1_Flag水平**（d）**对转染HA-Parkin的SH-SY5Y细胞进行毒素处理，对HA（绿色）和线粒体p60抗原（红色）进行免疫标记，并分析HA-Parpin在线粒体的重新分布**（e）**.比例尺：10μm。FCCP诱导Parkin向线粒体移位**（e），**箭头所示），这在其他有丝分裂刺激中是看不到的。用载体（V）、6-OHDA（O，120μM）或Rot（R，1μM）处理SHSY5Y细胞，制备细胞溶胶和线粒体颗粒。凝胶中装载细胞溶质或线粒体蛋白，并进行p62/SQSMT1免疫印迹，以及指示的分馏标记**（f）**.SH-SY5Y细胞中p62/SQSMT1分布的共焦分析**（g）**初级皮层神经元**（h）**与mCherry标记的p62/SQSMT1和线粒体靶向GFP联合转染。注意大线粒体聚集体中p62的补充**（g），**黄色，箭头）。未切割印迹见图S7。

**图5。线粒体识别线粒体自噬需要LC3的N-末端氨基酸**
用Blue Native PAGE分析重组LC3与四油酰基心磷脂（TOCL）或二油酰基磷脂酰胆碱（DOPC）脂质体以指定摩尔比孵育**（a）；**脂质体结合破坏了蛋白质的凝胶进入。对磷脂（例如TOCL）与LC3进行滴定，以评估阻止50%LC3进入凝胶（IC50）的比率，作为相对亲和力指数**（b）**插图：TOCL与二油酸-磷酸（DOPA）和四亚油酸基-CL（TLCL）的IC50值与单唾液酸-三亚油酸基-CL（lysoCL）之间的比较。DOPG的IC50大于15。*与TOCL相比p<0.05；†p<0.05s.薄层色谱。通过对接分析CL与LC3结合的相互作用位点的分子模型。CL为顶级结合位点构象中的洋红色**（c），**和交替构象的青色**（d），**以磷酸盐为球体（含氧，磷橙色）。与CL相互作用的氨基酸表现为沿着LC3带状结构的球体，从N>C末端呈蓝色>橙色。39个LC3家族序列（包括亚型A-C）与ClustalW对齐，并使用WebLogo显示，符号高度与相对氨基酸频率相对应**（e） ●●●●。**星号表示预计在有利构象（洋红色）和交替构象（青色）中与CL接触的残基。箭头显示了用于创建GFP-LC3缺失突变体的N末端截断位置，这些突变体用于分析GFP-LC3punta的形成**（f、g、i）**和参与有丝分裂**（小时）**响应指示的刺激。根据预测的CL接触残基制备双点突变**（e），**并分析Rot或6-OHDA诱导的有丝分裂参与情况**（k） ●●●●。**插图：GFP-LC3质粒的表达（补充图S7中的非剪切印迹）。n的平均+/-s.d.=f-h的3个独立实验，i，j的n=4个独立实验（见统计数据源表）；*p<0.05与各自车辆†与经毒性处理的WT相比，p<0.05。

**图6。概述CL在线粒体自噬中拟议作用的示意图**
线粒体损伤导致CL依赖PLS3外化至线粒体外表面。CL与LC3 N末端结构域的相互作用有助于货物靶向自噬体。预计通过有丝分裂清除CL暴露的线粒体（绿色箭头）可以防止CL氧化和促凋亡信号的积累（红色箭头）。

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