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.2014年6月5日；33(23):3004-13.
doi:10.1038/onc.2013.256。 Epub 2013年7月8日。

JNK介导的自噬途径触发抗癌化疗中c-IAP降解和坏死

W He公司 1, Q王 2, B斯里尼瓦桑 三, 徐军（J Xu） 4, M T帕迪拉 4, Z李 4, X王 5, Y刘 4, X苟 6, H-M Shen公司 7, C星 三, 林毅 4
附属公司

JNK介导的自噬途径触发抗癌化疗中c-IAP降解和坏死

W He公司等。 癌基因. .

摘要

通过诱导凋亡杀死癌细胞是化疗的主要机制之一。然而，许多癌细胞具有原发性或获得性凋亡抵抗，导致化疗耐药。在本研究中，我们使用一种新的查尔酮衍生物查尔酮-24（Chal-24），通过自噬介导的坏死（RIP1-和RIP3-依赖性坏死），确定了一种新型的抗癌机制。Chal-24通过诱导坏死细胞形态而有效地杀死不同的癌细胞，但未引起可检测到的caspase激活。用坏死抑素-1或通过敲除RIP1和RIP3来阻断坏死性凋亡途径，有效地阻断了Chal-24的细胞毒性，表明Chal-24诱导的细胞死亡与坏死性凋亡有关。Chal-24强烈激活JNK和ERK，并阻断其有效抑制Chal-24诱导的细胞毒性。此外，Chal-24强烈诱导自噬，自噬依赖于JNK介导的Bcl-2和Bcl-xL磷酸化以及Bcl-2或Bcl-xL与Beclin-1的分离。重要的是，通过药物抑制剂或靶向重要自噬成分ATG7和Beclin-1的小干扰RNA抑制自噬，可以有效减弱Chal-24诱导的细胞死亡。此外，我们发现自噬激活导致c-IAP1和c-IAP2降解，并形成Ripoptosome，导致细胞坏死。因此，这些结果建立了一种杀死癌细胞的新机制，该机制涉及自噬介导的坏死性凋亡，可用于克服化疗耐药性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1。Chal-24诱导非凋亡细胞死亡
（A）用指示浓度的Chal-24处理细胞30 h。通过LDH释放试验测量细胞死亡。所示数据为平均值±SD。（B）在指定的时间点用Chal-24处理细胞（A549为8μM，UM-UC-3为4μM）。Western blot检测所示蛋白。GAPDH被检测为输入控制。用TRAIL（A549为200 ng/mL，UM-UC-3为60 ng/mL）处理8 h的细胞作为凋亡细胞死亡的对照。（C）用z-VAD（5μM）预处理A549 30 min，然后用Chal-24（8μM）或TRAIL（200 ng/mL）再处理30 h。通过LDH释放试验测量细胞死亡。所示数据为平均值±SD。（D）A549用Chal-24（8μM）或TRAIL（200 ng/mL）处理24小时，并用吖啶橙和溴化乙锭染色。白色箭头表示坏死细胞。红色箭头表示凋亡细胞。
图2
图2。Chal-24诱导的细胞死亡需要JNK和ERK激活
（A）用Chal-24（8μM）处理A549细胞指定时间。通过蛋白质印迹检测所指示的蛋白质。GAPDH被检测为输入控制。（B）用指示的抑制剂预处理A549 30 min，然后用Chal-24（8μM）处理30 min。用Western blot检测指示蛋白。GAPDH被检测为输入控制。（C）用指示的抑制剂SP600125（10μM）、U0126（10μM）、SB203580（5μM）预处理A549细胞30 min，然后用Chal-24（8μM）再处理30 h。通过LDH释放试验检测细胞毒性。所示数据为平均值±标准偏差。*p<0.01。
图3
图3。Chal-24诱导癌细胞自噬
（A–B）用Chal-24处理细胞（A549为8μM，UM-UC-3为4μM）指定时间。Western blot检测所示蛋白。β-actin被检测为输入对照。（C–D）用氯喹（CQ，20μM）预处理细胞30 min，然后用Chal-24（8μM用于A549，4μM用于UM-UC-3）再处理2 h（对于LC3）或8 h（对于p62）。Western blot检测所示蛋白。GAPDH被检测为输入控制。(E类)稳定转染GFP-LC3的A549用Chal-24（8μM）处理2h或保持未处理状态。照片是在荧光显微镜下拍摄的。(F类)用GFP点（左）和每个阳性细胞的点数量化细胞数。所示数据为平均值±标准偏差。*p<0.01。
图4
图4。Chal-24依赖自噬诱导细胞死亡
（A）用3MA（10 mM）、CQ（20μM）或Wortmannin（WTM，1μM）预处理A549细胞30 min，然后用Chal-24（8μM）再处理30 h。通过LDH释放试验检测细胞毒性。所示数据为平均值±标准偏差。*p<0.01。（B）用不同的抑制剂（CQ，20μM；WTM，1μM；3MA，10 mM）预处理A549细胞30 min，然后用Chal-24（8μM）再处理2 h。用Western blot检测指示蛋白。β-actin被检测为输入对照。（C、D）用指示的siRNA（10nM）转染细胞30小时，然后用Chal-24（8μM）再处理30小时。通过LDH释放测定检测细胞毒性。所示数据为平均值±标准偏差。*p<0.01。插入物，通过Western blot确认每个蛋白的敲除。β-actin被检测为输入对照。（E） ●●●●。用指示的siRNAs（10 nM）转染A549细胞30 h，然后用Chal-24（3μM）处理3天，然后在每3天刷新一次的新鲜培养基中培养。培养8天后，用甲醇固定细胞并用亚甲基蓝染色。显示了整口井的代表性图像。
图5
图5。Chal-24诱导的自噬涉及JNK介导的Bcl-2和Bcl-xL磷酸化
（A、B）用指示的抑制剂SP600125（10μM）、U0126（10μM）、SB203580（5μM），WTM（1μM）或CQ（20μM）预处理A549 30 min，然后用Chal-24（8μM）再处理2 h。用Western blot检测指示的蛋白。β-actin或GAPDH被检测为输入对照。（C、D）用Chal-24处理细胞（A549为8μM，UM-UC-3为4μM）指定时间。Western blot检测所示蛋白。β-actin或GAPDH被检测为输入对照。（E）A549细胞用SP600125（10μM）预处理30 min，然后用Chal-24（8μM）再处理2 h。对于Lambda蛋白磷酸酶（Lambda PP）处理，细胞提取物与Lambda聚丙烯（400 u/μl）在30℃孵育1 h。Western blot检测所示蛋白。β-actin或GAPDH被检测为输入对照。（F）A549用SP600125（10μM）预处理30 min，然后用Chal-24（8μM）再处理2 h。在与Beclin-1抗体共免疫沉淀后，用Western blot检测指示蛋白。
图6
图6。Chal-24依赖自噬和ERK诱导c-IAP降解
（A）用Chal-24（8μM）处理A549细胞指定时间。Western blot检测所示蛋白。β-actin或GAPDH被检测为输入对照。（B）用ERK1和ERK2 siRNA或JNK1和JNK2 siRNA（各10nM）的组合转染A549细胞24小时，然后用Chal-24（8μM）再处理30小时。通过蛋白质印迹检测所指示的蛋白质。GAPDH被检测为输入控制。（C）用3MA（10 mM）、CQ（20μM）或沃特曼（WTM，1μM）预处理A549细胞30 min，然后用Chal-24（8μM）再处理30 h。用Western blot检测所示蛋白。GAPDH被检测为输入控制。（D）用指示的siRNAs（10nM）转染A549 24小时，然后用Chal-24（8μM）再处理30小时。检测GAPDH作为输入对照。（E）用U0126（10μM）预处理A549细胞30分钟，然后用Chal-24（8μM）处理指定时间。Lambda磷酸酶处理如5E所述。通过蛋白质印迹检测所指示的蛋白质。GAPDH被检测为输入控制。（F）A549用Chal-24（8μM）处理指定时间。与RIP1抗体共同免疫沉淀后，用Western blot检测所示蛋白（G）用CQ（20μM）预处理A549 30 min，然后用Chal-24（8μM）再处理30 h。在与RIP-1抗体共免疫沉淀后，用Western blot检测指示蛋白。检测GADPH作为联合免疫沉淀特异性的对照。
图7
图7。Chal-24诱导癌细胞凋亡
（A）用Chal-24（8μM）处理A549细胞指定时间。Western blot检测培养基中的指示蛋白。培养基中主要蛋白成分BSA的Commassie蓝染色用作输入对照。（B）用坏死素-1（20μM）预处理A549细胞30 min，然后用Chal-24（8μM）再处理30 h。通过LDH释放试验检测细胞毒性。所示数据为平均值±标准偏差。*p<0.01。（C）用指示的siRNAs（10 nM）转染A549和UM-UC-3细胞30 h，然后用Chal-24处理30 h（A549为8μM，UM-UC-3为4μM）。通过LDH释放试验检测细胞毒性。所示数据为平均值±标准偏差。*p<0.01。通过蛋白质印迹证实了每种蛋白质的敲除。β-actin被检测为输入对照。（D）Chal-24诱导的细胞死亡模型。
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参考文献

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