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.2013年5月20日；8（5）：e63502。
doi:10.1371/journal.pone.0063502。 2013年印刷。

天然龙脑是一种单萜类化合物，通过增强细胞摄取和激活ROS介导的DNA损伤，增强硒代胱氨酸诱导的人肝癌细胞凋亡

苏建宇 1, 赖浩强, 陈建平, 林莉（Lin Li）, 黄玉成, 陈天峰, 李晓玲
附属公司

天然冰片是一种单萜类化合物，通过增强细胞摄取和激活ROS介导的DNA损伤，增强硒代半胱氨酸诱导的人肝癌细胞凋亡

苏建宇等。 公共科学图书馆综合版. .

摘要

硒代半胱氨酸（SeC）是一种具有广谱抗癌活性的新型化合物。天然龙脑（NB）是一种单萜类化合物，已被用作药物吸收的促进剂。在本研究中，我们证明NB通过诱导细胞凋亡，显著增强了细胞对SeC的摄取，并增强了其对HepG2细胞的抗增殖活性。NB通过触发凋亡细胞死亡，有效协同SeC减少癌细胞生长。Western blotting进一步的机制研究表明，用NB和SeC处理细胞通过调节促生存和促凋亡Bcl-2家族蛋白激活了固有的凋亡途径。用NB和SeC处理细胞可诱导p38MAPK的激活和Akt和ERK的失活。NB还可增强SeC以触发细胞内ROS的生成和彗星试验检测到的DNA链断裂。此外，硫醇还原性抗氧化剂有效阻止了细胞凋亡的发生，证实了活性氧在细胞凋亡中的重要作用。综上所述，这些结果表明，NB通过增强细胞对ROS介导的DNA损伤的摄取和激活，强烈增强了SeC诱导的癌细胞凋亡。NB可作为SeC的化学增敏剂进一步开发用于人类癌症的治疗。

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数字

图1
图1。NB增强SeC对HepG2细胞的生长抑制作用。
（A） 通过ICP-AES分析对暴露于80µg/ml NB和/或20µM SeC 24小时的细胞对Se的摄取进行定量分析。（B） NB和SeC联合处理24小时和（C）NB预处理12小时后与SeC孵育24小时诱导的细胞生长抑制（D）光镜检查处理后细胞的MTT染色图像（放大200倍）。
图2
图2。NB增强SeC的凋亡诱导作用。
（A） NB增强SeC诱导HepG2细胞凋亡。收集处理后的细胞，用70%乙醇固定，然后用碘化丙啶染色。通过量化Sub-G1峰来测量亚二倍体DNA含量的凋亡细胞。（B） TUNEL分析和DAPI染色检测到的对联合处理反应的DNA片段化和核浓缩的代表性显微照片。用80µg/ml NB预处理细胞12小时，然后用20µM SeC再处理24小时（放大倍数200倍）。此处的所有数据均表示为三份的平均值±SD。这里显示的所有图像都是三个具有类似结果的独立实验的代表。具有不同字符（a、b、c和d）的条形图在对<0.05级。（C） 通过Caspase-3/8/9的特定荧光底物测量的Caspase活性。治疗组和对照组之间的显著差异显示于对<0.05 (*)和对<0.01 (**)级别。（D） Western blot分析NB和SeC处理24 h的HepG2细胞中caspase激活和PARP裂解。通过剥离免疫印迹和重组β-肌动蛋白证实了负载相等。这里显示的所有结果都是具有类似结果的三个独立实验的代表。（E） 半胱天冬酶和PARP的蛋白表达作为对照的百分比。治疗组和对照组之间的显著差异显示于对<0.05 (*)和对<0.01 (**)级别。
图3
图3。NB联合SeC对Bcl-2家族蛋白表达水平的影响。
（A） Bcl-2家族蛋白的Western blot分析。用80µg/ml NB预处理细胞12 h，然后用20µM SeC再培养24 h。（B）Bcl-2家族的蛋白表达水平作为对照的百分比。这里显示的所有结果都是具有类似结果的三个独立实验的代表。治疗组和对照组之间的显著差异显示于对<0.05 (*)和对<0.01 (**)级别。
图4
图4。NB和SeC诱导的DNA损伤介导的p53激活。
（A） NB增强SeC诱导的磷酸化p53、总p53和组蛋白的上调。用80µg/ml NB预处理细胞12小时，然后用20µM SeC再培养24小时。通过Western blotting方法检测测试蛋白的表达水平。（B） 彗星实验在单细胞水平证明，NB增强了SeC诱导的DNA损伤。处理后的细胞立即通过彗星试验进行分析，如材料和方法一节所述。尾巴的长度反映了细胞中DNA的损伤。这里显示的所有图像都是三个具有类似结果的独立实验的代表。（C） 磷酸化p53和Total-p53的蛋白表达水平作为对照的百分比。治疗组和对照组之间的显著差异显示于对<0.05 (*)和对<0.01 (**)级别。
图5
图5。NB和SeC对Akt和MAPK信号通路的影响。
（A） NB和SeC对磷酸化状态和Akt表达水平的影响。用指定浓度的NB和SeC处理细胞相应的时间。（B） NB和SeC治疗后p38 MAPK和ERK的磷酸化状态和表达水平。免疫印迹是三个具有类似结果的独立实验的代表。（C） MAPKs家族和Akt蛋白的表达作为对照的百分比。治疗组和对照组之间的显著差异显示于对<0.05 (*)和对<0.01 (**)级别。
图6
图6。细胞内ROS生成在NB和SeC联合诱导HepG2细胞凋亡中的作用。
（A） 将细胞暴露于指定浓度的NB和SeC不同时间，通过测量氧化敏感荧光素DCFH-DA的荧光强度来分析细胞内ROS水平。用80µg/ml NB和20µM SeC处理细胞不同时间。（B） NAC对NB和SeC诱导的细胞凋亡的影响。细胞在加入NB和SeC之前用2 mM NAC预处理或4 h。通过流式细胞仪分析测定细胞凋亡。所有结果均来自三个独立的实验。具有不同字符（a、b和c）的条形图在P<0.05水平上存在统计差异。
图7
图7。HepG2细胞中NB和SeC联合触发的拟议信号通路。
NB增强细胞对SeC的摄取，随后增加细胞内ROS生成和DSB。DNA损伤激活p53通路，通过调节Bcl-2家族成员的表达水平导致线粒体功能障碍。线粒体功能障碍导致凋亡因子释放到胞浆中，然后激活多个caspase级联反应，最终导致细胞凋亡。此外，线粒体中产生的活性氧作为一个功能环，促进p38MAPK的磷酸化和Akt和ERK的失活，从而增强p53的激活并增强凋亡级联。
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赠款和资金

本研究得到了国家自然科学基金（31101278、31130042、21271002和21201082）和广东省973计划（2012CB720800）、国家科技支撑计划（2012BAD37B01）、教育部博士基金、，高等教育博士点研究基金（20110172120033）。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿准备方面没有任何作用。