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.2013年5月13日；201(4):613-29.
doi:10.1083/jcb.201206006。 Epub 2013年5月6日。

p53依赖性Alarmin HMGB1的释放是衰老表型的中心介体

阿尔伯特·R·达瓦洛斯 1, 川原美子, Gautam K Malhotra公司, 尼古拉斯·沙姆, 黄嘉豪, 乌尔维吠陀, Christian M Beausejour先生, 让-菲利普·科佩, 弗朗西斯·罗德尔, 朱迪斯·坎皮西
附属公司

p53依赖性Alarmin HMGB1的释放是衰老表型的中心介体

阿尔伯特·R·达瓦洛斯等。 J细胞生物学. .

摘要

细胞衰老不可逆地阻止增殖，以应对潜在致癌应激。衰老细胞还分泌炎症细胞因子，如IL-6，促进年龄相关性炎症和病理学。HMGB1（高迁移率组框1）调节细胞核中的基因表达，但某些免疫细胞分泌HMGB1作为细胞外警报蛋白，以指示组织损伤。我们发现核HMGB1在培养和体内衰老的人和小鼠细胞中重新定位到细胞外环境。与细胞因子分泌相反，HMGB1的再分配需要p53肿瘤抑制因子，而不是其激活因子ATM。此外，HMGB1表达的改变导致p53依赖性衰老生长停滞。衰老成纤维细胞分泌氧化HMGB1，通过TLR-4信号刺激细胞因子分泌。HMGB1缺失、HMGB1阻断抗体或TLR-4抑制减弱衰老相关IL-6分泌，外源性HMGB1刺激NF-κB活性并恢复HMGB1-d细胞的IL-6分泌。我们的研究结果表明，衰老是一种新的生物环境，HMGB1在其中发挥作用，并将HMGB1的重新分布与p53活性和衰老相关炎症联系起来。

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数字

图1。
图1。
HMGB1在SEN人细胞中重定位。（A） 10的全细胞裂解物（WC）5WI-38人成纤维细胞，PRE或通过X射线照射（XRA）制备SEN，复制衰竭（REP），p16INK4a公司通过Western blotting分析HMGB1和肌动蛋白（对照）的过表达（p16）或致癌RAS。（B） 对A中描述的IMR-90成纤维细胞进行HMGB1（红色）免疫染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。平行细胞用BrdU标记（48 h），并对SA-β-Gal活性进行染色；显示的值是单元格的百分比。棒材，10μM。（C） 通过IMR90细胞CM中的乳酸脱氢酶测定细胞毒性。误差条是一式三份样品的标准偏差。（D） 在XRA后的指定时间，我们通过ELISA分析IMR90细胞的CM中HMGB1。图中所示为在0.2%血清中培养3天使细胞静止的倍数增加。误差条是三份样品的SEM。（E） 从PRE和复制的REP IMR-90细胞中收集CM和全细胞裂解物（WC），通过Western blotting分析HMGB1和肌动蛋白。与肌动蛋白相关的表达式显示在每条车道的下方。
图2。
图2。
HMGB1在SEN小鼠细胞中重新缩放。（A） 对PRE或SEN（XRA）MEF进行HMGB1免疫染色（红色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。棒材，10μM。（B） 用蛋白质印迹法分析PRE或SEN（XRA）MEF的裂解产物中的HMGB1和肌动蛋白（对照）。（C） 用ELISA法分析PRE或XRA细胞CM中的HMGB1。误差线是重复样本的平均值。（D） 6-8周龄C57BL/6小鼠为未照射（对照组）或亚致死照射（IR）小鼠。1周后收集的肾脏进行HMGB1免疫染色（红色）；细胞核用DAPI（蓝色）染色。棒材，25μM。（E） 对B组小鼠肾脏进行核（Nuc）或核+细胞质（Nuc+细胞）HMGB1免疫染色。对2–3只对照或辐照（IR）小鼠的200多个细胞核进行盲法评分；误差条为SEM。（F）对4个月龄和32个月龄C57BL/6小鼠肾脏进行HMGB1免疫染色（红色）；细胞核用DAPI（蓝色）复染。棒，10μM。（G） 采用ELISA法检测指定年龄段小鼠的血清HMGB1。Kruskal-Wallis检验用于确定显著性（***，P<0.001）。
图3。
图3。
衰老细胞分泌乙酰化HMGB1。（A） 给予WI-38细胞PBS（−，对照）或200 ng/ml曲古抑菌素A（TSA）（+）4 h，并用泛乙酰赖氨酸（绿色）和HMGB1（红色）特异性抗体进行免疫染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。棒材，20μM。（B） 来自PRE和SEN（XRA）IMR-90细胞的CM通过小鼠IgG（对照）或乙酰赖氨酸（Ac-L）抗体免疫沉淀。通过HMGB1的Western blotting分析沉淀和5%的未经处理（输入）CM。%总量=乙酰化HMGB1免疫沉淀量与CM中HMGB1总量的比较。
图4。
图4。
HMGB1从衰老细胞核中积极输出。（A） 将SEN（XRA）HCA2细胞与二甲基亚砜（−，对照）或20 nM钩霉素B（LMB）（+）培养3 h，并对HMGB1（红色）和53BP1（绿色）进行染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。棒材，10μM。（B） REP SEN HCA2细胞按A培养，HMGB1染色（红色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。棒材，10μM。（C） HCA2细胞给予5 nM staurosporine或20 nM LBM 6 h，并染色活性caspase-3（红色；显示%阳性细胞）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。巴，10μM。（D） 给予PRE（XRA−）或SEN（XRA+）IMR-90细胞DMSO（−）或者20 nM LMB（+）3 h。通过Western blotting分析裂解液中的HMGB1和肌动蛋白（对照）。显示了归一化为肌动蛋白并相对于PRE细胞（1.0）的表达。（E） 用ELISA法分析D组CM中HMGB1的含量。误差条=三份样品的SEM。（F） HCA2细胞在不含或含0.5 mM H的培养基中培养2哦2清洗2小时，并用二甲基亚砜或LMB孵育16小时。通过HMGB1的Western blotting分析CM。数据代表至少两个独立实验。
图5。
图5。
HMGB1缺失或过度表达导致衰老。（A） 通过蛋白质印迹分析用不携带插入物（载体）或HMGB1 shRNA（shRNA1，2）的慢病毒感染的IMR-90细胞的裂解物中的HMGB1和肌动蛋白（对照）。显示的是相对于Vector的表达式级别。（B） 对A细胞进行HMGB1免疫染色（红色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。显示REP SEN单元格以进行比较。棒材，10µM。（C） 对B细胞进行SA-β-Gal、BrdU（24小时脉冲）和SAHF评分。误差条=两个独立实验的SEM。（D） 通过Western blotting分析感染无插入物（载体）或HMGB1（OE）慢病毒的IMR-90细胞的裂解液中的HMGB1和肌动蛋白（对照）。显示的是相对于Vector的表达式级别。（E） 对D细胞进行HMGB1免疫染色（红色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。显示REP SEN单元格以进行比较。棒材，10µM。（F） 对E细胞进行SA-β-Gal、BrdU（24小时脉冲）和SAHFs评分。显示REP SEN单元格以进行比较。误差条=两个独立实验的SEM。（G） 分析PRE IMR-90细胞或由XRA（XRA）、HMGB1-o过表达（OE）或HMGB1-d缺失（KD）诱导衰老的细胞的裂解液中的p53、p16INK4a公司和肌动蛋白（对照）。（H） 通过ELISA分析来自PRE或SEN（REP、XRA和HMGB1 OE或KD）IMR-90细胞的CM中的IL-6。所示为两个实验的代表。误差线=重复测定的SEM。（一） 表达NF-κB荧光素酶报告子的HCA2细胞被携带GFP shRNA（对照）、RelA shRNA、HMGB1 cDNA（OE）或HMGB1 shRNA（KD）的慢病毒感染。选择后7天，在无血清培养基中给予shGFP和shRel A细胞TNF 24小时。对细胞进行裂解并测量荧光素酶活性（给予BSA（对照）蛋白的细胞的倍数变化）。采用单因素方差分析对各组进行分析；P<0.001。（J） 感染HMGB1 OE慢病毒的细胞被HMGB1（红色）和细胞核（DAPI；蓝色）染色。棒材，10μM。（K） 用ELISA法检测感染无插入（对照）或HMGB1-expressing（OE）慢病毒细胞的CM中HMGB1的含量。误差线=重复测定的SEM。（五十） 感染无插入物（V）或过表达HMGB1（OE）慢病毒的IMR-90细胞用小鼠IgG或HMGB1阻断抗体（BA）培养5 d，并评估EdU掺入。误差线=重复测定的SEM。
图6。
图6。
第16页INK4a公司不调节SEN细胞中的HMGB1。（A） 感染无插入物（V）或p16慢病毒的IMR-90细胞的裂解物INK4a公司分析p16的shRNA（p16 KD）INK4a公司和肌动蛋白（对照）。（B） p16缺失的PRE和SEN（XRA）IMR-90细胞INK4a公司HMGB1免疫染色（红色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。棒材，10µM。（C） PRE IMR-90细胞或感染无插入物（V）或p16慢病毒的细胞的裂解物INK4a公司shRNA（p16 KD）。用X射线照射（XRA）使p16KD细胞衰老，10天后进行分析。通过Western blotting分析细胞HMGB1和肌动蛋白（对照）。（D） p16缺失的IMR90细胞INK4a公司感染了不携带插入物（V）、HMGB1 cDNA（OE）或HMGB1 shRNA（KD）的慢病毒，并对其进行SA-β-Gal染色。误差条=两个独立实验的SEM。（E） 表达或耗尽p16的IMR-90细胞INK4a公司感染了不携带插入物（V）、HMGB1 shRNA（KD）或HMGB1 cDNA（OE）的慢病毒。10天后，对细胞进行SAHF评分。误差条=两个独立实验的SEM。（F） 用携带GFP（对照）或p16（OE）的慢病毒感染的IMR-90细胞对SA-β-Gal和BrdU掺入（24小时脉冲）进行评分，并对HMGB1（红色）进行免疫染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。XRA诱导的SEN细胞用于比较。棒材，10µM。
图7。
图7。
HMGB1表达改变引起的HMGB1重定位和衰老需要p53。（A） 通过Western blotting分析感染表达GSE（+）或阴性慢病毒的XRA SEN HCA2细胞的裂解物（WC）和CM中的HMGB1和微管蛋白（对照）。可检测蛋白质的比例在每条车道下方给出。（B） 通过ELISA分析来自表达对照（V）或表达GSE的慢病毒的PRE或SEN（XRA）HCA2细胞的CM的HMGB1。（C） 通过Western blotting分析XRA SEN IMR90细胞感染表达shp53（+）或阴性慢病毒的裂解物（WC）或CM的HMGB1和肌动蛋白（对照）。可检测蛋白质的比例在每条车道下方给出。（D） 用ELISA法分析表达对照（V）或shp53（KD）慢病毒的PRE或SEN（XRA）IMR90细胞CM的HMGB1。（E） 感染表达慢病毒的对照组（GFP；−）或GSE（+）的REP SEN HCA2细胞进行HMGB1（红色）免疫染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。棒材，10µM。（F） 表达（+）或缺失p53（−）的IMR-90和HCA2细胞感染无插入物（载体）、致癌RAS、HMGB1 shRNA（KD）或HMGB1（OE）的慢病毒，并在3d后对SA-β-Gal进行评分。误差条=两个独立实验的SEM。（G） B细胞感染了不携带插入物（载体）、HMGB1（OE）或HMGB1 shRNA（KD）的慢病毒。感染后6d，对细胞进行HMGB1（红色）免疫染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。棒材，10µM。（H） 通过ELISA分析来自感染无插入物（V）、shp53（p53-KD）和/或HMGB1（OE）的慢病毒的细胞的CM的HMGB1。误差条=三份样品的SEM。
图8。
图8。
ATM对HMGB1分泌是必不可少的。（A） 对PRE或SEN（XRA）HCA2细胞和两株A-T衍生成纤维细胞株（AT2SF，AT5283）进行HMGB1（红色）免疫染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。棒材，10µM。（B） 对A中的细胞进行SA-β-Gal和BrdU掺入评分（24小时脉冲）。误差棒=两个实验的SEM。（C） 用ELISA法检测A细胞的CM分泌HMGB1。误差棒=两个实验的SEM。（D） 通过Western blotting分析携带GFP（Control）或ATM（KD）shRNA的慢病毒感染HCA2细胞的裂解液和A-T成纤维细胞（AT2SF）的裂解液中的HMGB1和肌动蛋白。HMGB1信号被归一化为肌动蛋白，并与shGFP相关。
图9。
图9。
HMGB1调节SASP因子。（A） 对PRE和SEN（XRA）WI-38细胞进行HMGB1（红色）免疫染色。DAPI染色细胞核（蓝色）。对图像进行均匀增强以检测SEN细胞中的HMGB1。棒材，10µM。（B） XRA SEN WI-38细胞被携带GFP或两种HMGB1（HMGB1-1，HMGB1-2）shRNAs的慢病毒感染。4d后收集CM，用ELISA检测IL-6和MMP-3。显示的是相对于shGFP的折叠变化。误差棒=两个实验的SEM。（C） PRE或SEN（XRA）HCA2细胞与2、4和8µg/ml小鼠IgG或HMGB1阻断抗体孵育。采用ELISA法检测CM中IL-6的含量。误差线=三份样品的SEM。**，P<0.02。（D） CM是从模拟照射或照射后24小时或7天的IMR90细胞中收集的。在存在（+）或不存在（-）5 mM DTT的情况下加热CM，然后通过Western blotting进行分析。指出了还原（全硫醇）和氧化（二硫化物）HMGB1的位置。（E） 用表达shTLR-4的慢病毒感染IMR90细胞，并评估TLR-4 mRNA和IL-6的相对分泌。在不表达插入物或TLR-4 shRNA（TLR4-KD）的模拟（M）或X射线照射（XRA）SEN细胞中，或在存在或不存在TLR-4抑制剂CLI-95的培养条件下，评估IL-6的分泌。所示为相对于无CLI-95模拟辐射细胞的折叠表达。误差条=三份样品的SEM。（F） 将IMR90细胞与400 ng/ml BSA、20 ng/ml TNF或400 ng/ml重组HMGB1一起培养20分钟，并对NF-κB（p65亚单位；绿色）进行免疫染色。DAPI染色细胞核（蓝色）。棒材，10µM。（G） 选择感染shGFP或shHMGB1-expressing慢病毒的HCA2细胞7 d，并用指定浓度的BSA、重组HMGB1、TNF或IL-1α培养24 h。采用ELISA法检测CM中IL-6的含量。误差条=三份样品的SEM。（H） 表达NF-κB荧光素酶报告子的HCA2细胞被表达shGFP或shHMGB1的慢病毒感染。选择后7天，将细胞与指示蛋白在G浓度的无血清培养基中培养24小时。细胞被裂解并测定荧光素酶。荧光素酶水平是与BSA孵育的细胞的倍数变化。采用单向方差分析法对各组进行分析；P＜0.001。
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