Overexpression of endoglin modulates TGF-β1-signalling pathways in a novel immortalized mouse hepatic stellate cell line

doi:10.1371/journal.pone.0056116

.2013;8（2）：e56116。

doi:10.1371/journal.pone.0056116。 Epub 2013年2月20日。

内皮素过度表达对新型永生化小鼠肝星状细胞系TGF-β1信号通路的调节

斯特芬·K·梅勒¹, 穆罕默德·阿尔萨曼, 哈塞·萨欣, 赫尔曼·瓦斯穆特, 塔蒂亚娜·基塞莱娃, 大卫·A·布伦纳, 克里斯蒂安·特劳特温, 拉尔夫·魏基尔琴, 大卫·肖尔滕

附属公司

PMID： 23437087
PMCID公司：项目经理3577806
内政部： 10.1371/日志.pone.0056116

内皮素过度表达对永生化小鼠肝星状细胞系TGF-β1信号通路的调节

斯特芬·K·梅勒等。公共科学图书馆一号. 2013.

.2013;8（2）：e56116。

doi:10.1371/journal.pone.0056116。 Epub 2013年2月20日。

作者

附属

¹德国亚琛RWTH大学亚琛医院临床化学和病理生物化学研究所。

PMID： 23437087
PMCID公司：项目经理3577806
内政部： 10.1371/日志.pone.0056116

摘要

肝星状细胞（HSC）在肝纤维化的发病机制中起着重要作用。在主要HSC上工作需要困难的隔离程序；因此，我们在胶原蛋白1（I）启动子/增强子的控制下，生成了表达GFP的小鼠肝星状细胞系，并对其进行了表征。这些细胞对促纤维化刺激（如PDGF或TGF-β1）有反应，并能够激活细胞内信号通路，包括Smads和MAP激酶。然而，由于基础水平的激活，与TGF-β1调节内源性I型胶原表达相比，TGF-α1并未显著诱导GFP表达。我们可以证明，辅助TGF-β-受体内切蛋白（内源性表达水平很低）在短暂过度表达时对这些细胞的信号传递有不同的影响。在内皮素的存在下，Smad1/5/8的活化显著增强。此外，ERK1/2的磷酸化增加，波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和结缔组织生长因子的表达上调。内皮素诱导分化抑制因子-2的表达略有增加，而内源性I型胶原的数量减少。因此，这种来源于肝星状细胞的促纤维化细胞系不仅是一种很有前途的新型实验工具，而且可以在体内用于细胞追踪实验。此外，它还可以研究各种调节蛋白（如endoglin）对促纤维化信号转导、分化和肝星状细胞生物学的影响。

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竞争利益：提交人声明不存在相互竞争的利益。

数字

**图2。Col-GFP细胞系的特性。**
携带α-SMA Col-GFP报告盒的细胞的免疫荧光染色(A类)、GFAP(B类)、突触素(C类). (D类)用紫外荧光显微镜检测GFP信号。(E类)通过定量PCR分析α-SMA、I型胶原、GFAP和p75的表达，并与静止的原代HSC（qHSC）和培养7天的活化HSC（aHSC）的表达进行比较。结果代表三个独立的实验，每个实验重复进行，误差条代表SEM值。(F类)细胞在各自的生长介质中培养，并使用针对纤维连接蛋白、ColIV、ColI、β-聚糖（与Endoglin交叉反应，[20]）、波形蛋白、结蛋白、α-SMA、CTGF、Id2、GFP的特异性抗体以及作为负荷对照的β-肌动蛋白分别提取和Western blot分析细胞蛋白。(**G公司**)为了演示ColI的表达，显示了曝光时间较长的图像（n=3）。

**图3。通过荧光信号进行功能表征。**
(A类)将Col-GFP细胞培养到不同的细胞密度，并在自动荧光阅读器中测量荧光信号。在密度为1.5×10的电池电镀后进行以下实验^三/好吧。(**B、 C类**)用指示浓度的CXCL9刺激细胞24小时，并且GFP含量相对于未处理细胞(D类)和手机号码(E类)已测量。(**D、 E类**)用指示浓度的ACC刺激细胞24小时，GFP含量相对于未处理细胞(D类)和手机号码(E类)已测量。(F类)显示用指示浓度的PDGF-BB刺激24小时，测量相对于未处理细胞的GFP含量。GFP的增加反映了细胞数量的增加（未显示）。结果代表三个独立的实验，每个实验在16个重复中进行，误差条代表SEM。

**图4。刺激Col-GFP细胞中的纤维生成信号。**
(A类)用指定浓度的TGF-β1（0.1 ng/ml；1.0 ng/ml）、BMP-2（25 ng/ml。制备细胞提取物，并通过Western blot检测细胞蛋白PDGFRβ、磷酸化Smad1/5/8（pSmad1/8/8）和Smad2（pSmad2）（I）、磷酸化形式的p38（p-p38）和ERK1/2（pERK1/2）、磷酸化ATF-2（pATF-2）（II）、Id2和GFP的表达。(B类)用EGF（50 ng/ml；100 ng/ml）刺激细胞达到指定的时间间隔。随后，制备细胞提取物，并使用特异性抗体对连接物磷酸化Smad2（pSmad2L）、磷酸化Smad 1/5/8（pSmad 1/8/8）（I）、磷酸形式的p38（p-p38）和ERK1/2（pERK1/2）、磷酸ATF-2（pATF-2）（II）和GFP进行Western blot分析。膜(**A、 B类**)与β-actin特异性抗体孵育，以证明蛋白质负载量相等。指示蛋白质的谱带强度(**A、 C类**)测量、归一化为β-actin并表示为未刺激样品的折叠诱导。结果显示了三个独立实验之一的代表性图像。

**图5。详细分析TGF-β1介导的短期和长期反应。**
(A类)用TGF-β1（0.1 ng/ml；1.0 ng/ml）、BMP-7（25 ng/ml。当指示时，在SB431542（SB，5µM）或多索吗啡（DM，1µM。此后，使用磷酸化Smad1/5/8（pSmad1/8/8）、C末端磷酸化Smad2（pSmad2）、磷酸化Smad 3（pSmad 3）、磷酸形式的p38（p-p38）和ERK1/2（pERK1/2）、CTGF、Id1、SV40-大T抗原（SV40）和GFP的特异性抗体，通过Western blot分析蛋白质提取物。(B类)用pSmad3-反应性荧光素酶报告子（CAGA）瞬时转染细胞₁₂-MLP-Luc公司。此后，在SB431542（5µM）存在或不存在的情况下，用（0.1 ng/ml；1.0 ng/ml）或不使用（0）TGF-β1刺激细胞6小时。对细胞进行裂解并测定荧光素酶活性，将其归一化为相应样品的蛋白质含量，并表示为对未刺激对照样品的折叠诱导。(C类)用转化生长因子-β1（0.1 ng/ml；1.0 ng/ml）刺激细胞48小时或不处理（Co.），并在饥饿期间（~16小时）与SB431542（SB，5µM）预孵育。此后，在刺激前（Co，0 h）采集第一个样本以监测蛋白质表达。刺激后，通过Western blot分析蛋白质提取物中Endoglin（带有对小鼠Endoglion特异的抗体）、TGF-β受体II（RII）、纤维结合蛋白、ColI、波形蛋白、α-SMA、CTGF、Id2和GFP的表达。膜(**A、 C类**)与β-肌动蛋白抗体孵育以监测等蛋白负荷.指示蛋白质的谱带强度(**A、 C类**)测量、归一化为β-actin并表示为未刺激样品的折叠诱导。所示结果显示了三个独立实验之一的代表性图像。

**图6。内皮素的内源性和异源性表达。**
(A类)将指示的小鼠细胞培养在生长培养基中（见图2F），并使用胶原蛋白I、内皮素（小鼠特异性）、波形蛋白、CTGF、α-SMA、Id2和GFP的特异性抗体通过Western blot分析细胞蛋白。为了验证瞬时转染小鼠内皮素cDNA（mEng）或空pcDNA载体作为对照（Co）的COS-7细胞的抗体特异性蛋白，我们进行了平行分析。这个实验重复了三次。(B类)使用指定的转染试剂和DNA与试剂的比率，用编码大鼠内切蛋白（rEng）的cDNA瞬时转染Col-GFP或COS-7细胞。制备相应细胞的细胞蛋白，并使用大鼠内皮素特异性抗体（PPabE2(**A、 B类**)与β-actin抗体孵育以监测等蛋白负荷。

**图7。内皮素对Col-GFP细胞TGF-β1反应的影响。**
(A类)用大鼠内皮素（Eng）或控制载体（pcDNA）的cDNA瞬时转染细胞。此后，用TGF-β1（0.1 ng/ml；1.0 ng/ml）刺激细胞或不治疗（Co）。在指定的时间后，制备细胞蛋白并通过Western blot使用针对大鼠内皮素（endoglin，PPabE2）、磷酸化Smad1/5/8（pSmad1/8/8）、C末端-（pSmad2）和连接蛋白磷酸化Smad2（pSmad2L）、磷酸化Smad3（pSma3）、ERK1/2磷酸化形式（pERK1/2）、，磷酸化ATF-2（pATF-2）、CTGF、Id2和GFP。(**B、 C类**)瞬时转染细胞并用TGF-β1刺激，或不按(A类)48小时。此后(**B、 C类**)和秘密的(B类)蛋白制备并用特异性内切蛋白抗体进行Western blot分析(B类)胶原蛋白I和CTGF(C类)波形蛋白、α-SMA和GFP。膜(**A–C**)与β-actin抗体孵育以监测等蛋白负荷。结果显示了三个独立实验之一的代表性图像。

**图8。内皮素对PDGF-BB信号传导的影响。**
(A类)使用Lipofectamine 2000和编码大鼠内皮素的cDNA瞬时转染细胞。此后，用或不用BMP-7（25 ng/ml）刺激细胞1小时或用PDGF-BB（25 ng/ml）刺激细胞10分钟。用内皮素（PPabE2）、PDGFRβ、磷酸化Smad1/5/8（pSmad1/8/8）、磷酸化ERK1/2（pERK1/2）和GFP的特异性抗体制备细胞蛋白并在Western blot中进行分析。(B类)如中所述，瞬时转染细胞(A类)在有或无SB431542（5µM）的情况下，用PDGF-BB（25 ng/ml）刺激或不刺激。随后，使用内切蛋白（PPabE2）、PDGFRβ、磷酸化ATF-2（pATF-2）、磷酸化ERK1/2（pERK1/2）和GFP的特异性抗体制备细胞蛋白并在Western blot中进行分析。所有膜均与β-肌动蛋白抗体孵育，以证明蛋白质负载量相等。为了进行密度分析，扫描了β-肌动蛋白和p-p42的条带，后者归一化为β-肌动蛋白。结果表示为相对于pcDNA对照的折叠诱导。结果显示了三个独立实验之一的代表性图像。

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这项工作得到了德国联邦科学基金会（SFB/TRR 57 P13）、亚琛工业大学和亚琛国立卫生研究院医学院START计划的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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[1] Bataller R，Brenner DA（2005）《肝纤维化》。临床研究杂志115:209–218。-项目管理咨询公司-公共医学

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