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.2013年3月；123(3):1068-81.
doi:10.1172/JCI64264。 Epub 2013年2月15日。

线粒体复合物I活性和NAD+/NADH平衡调节乳腺癌进展

安东尼奥·桑蒂德里安 1, Akemi Matsuno八木, 梅丽莎·里特兰, Byoung B Seo公司, 莎拉·勒博夫, 劳里·J·盖伊, 高雄八木, 布伦希尔德·费尔丁-哈伯曼
附属公司

线粒体复合物I活性和NAD+/NADH平衡调节乳腺癌进展

安东尼奥·桑蒂德里安等。 临床研究杂志. 2013年3月.

摘要

尽管临床治疗取得了进展，但转移仍是乳腺癌患者死亡的主要原因。线粒体DNA的突变，包括影响复合体I和氧化磷酸化的突变，在乳腺肿瘤中发现，并可能促进转移。这项研究确定线粒体复合物I对于定义乳腺癌细胞的侵袭性表型至关重要。线粒体复合物I活性的特异性增强通过调节肿瘤细胞NAD+/NADH氧化还原平衡、mTORC1活性和自噬抑制肿瘤生长和转移。相反，通过干扰烟酰胺磷酸核糖转移酶的表达，非致命性地降低NAD+水平，使肿瘤细胞更具侵袭性，并增加转移。研究结果转化为一种新的治疗策略：通过NAD+前体治疗增强NAD+/NADH平衡，抑制异种移植模型中的转移，提高动物存活率，并在MMTV-PyMT小鼠模型中强烈干预癌基因驱动的乳腺癌进展。因此，线粒体复合物I NADH脱氢酶活性的异常可以显著增强人类乳腺癌细胞的侵袭性，而NAD+/NADH平衡的治疗正常化可以抑制转移并防止疾病进展。

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数字

图1
图1。通过整合Ndi1增强线粒体复合物I活性：代谢特征。
(A类)双标记免疫细胞化学显示，慢病毒转导定位于线粒体后，Ndi1在MDA-MB-435和MDA-MB-231人癌细胞中表达。对照细胞（Ctrl）用空载体转导。所示为相同代表区域的Ndi1（绿色）、线粒体复合物V（红色）和合并（黄色）染色模式。原始放大倍数，×20。(B类)Ndi1整合到线粒体呼吸链并增强肿瘤细胞呼吸。通过耗氧量测量MDA-MB-435和MDA-MB-231（分别表示为“435”和“231”）控制和Ndi1-表达细胞的呼吸。R、 常规呼吸；腐烂、鱼藤酮（哺乳动物复合物I抑制剂）；AA，抗霉素A（复合III抑制剂）。所有参数均通过完整细胞的高分辨率呼吸测定法测量。(C类)Ndi1表达对MDA-MB-435和MDA-MB-231细胞代谢的影响。mtDNA含量通过实时定量PCR分析，并参考核基因组DNA。用流式细胞术分析线粒体膜电位，并用信号的几何平均值表示。ATP水平通过ATP依赖性荧光素酶活性测定。用荧光法测定乳酸产量。数据为平均值±SEM(n个= 3). *P（P）<0.05，未配对双尾学生t吨测试。
图2
图2。线粒体复合物I活性调节肿瘤生长和转移。
(A类)Ndi1表达抑制MDA-MB-435和MDA-MB-231细胞的乳腺脂肪垫肿瘤生长。用空载体转导对照细胞(n个= 6). (B类)静脉注射后，Ndi1表达抑制MDA-MB-435或MDA-MB-231细胞的肺定植（实验性转移）。用空载体转导对照细胞(n个= 6). (C类)静脉注射2.5×10后7周无创生物发光成像显示Ndi1表达抑制多器官实验性转移5MDA-MB-435对照细胞或Ndi1-表达细胞(n个= 5). (D类)敲低复合物I亚单位NFUFV1表达抑制MDA-MB-435细胞中的复合物I活性和呼吸能力。比较NDUFV1敲低（shV1）和对照（shCT）细胞。从细胞裂解物中免疫捕获复合物I，根据NADH氧化为NAD进行分析+，表示为平均OD/min/mg蛋白质(n个= 3). 通过高分辨率呼吸测定法在完整的MDA-MB-435对照细胞和NDUFV1敲除细胞中测量常规线粒体呼吸，校正氧化副反应引起的残余氧消耗(n个= 3). (E类)NDUFV1基因敲除增加MDA-MB-435细胞的肺定植活性。比较NDUFV1敲除细胞和对照细胞(n个= 8). 数据为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，非参数Mann-Whitney检验(A类,B类、和E类)或未配对的双尾学生t吨测试(D类).
图3
图3。线粒体复合物I活性调节mTORC1和自噬。
(A类)在含有5 mM与1 mM葡萄糖的培养基中培养72小时后，Ndi1表达增强了MDA-MB-231细胞对葡萄糖剥夺的抵抗力。通过流式细胞术测定存活率（非G0/G1亚群）。n个=3个独立分析*P（P）<0.05，未配对双尾学生t吨测试。(B类)Ndi1表达影响mTORC1活性和自噬。p62、磷酸化-AKT底物和mTORC1激酶相关底物磷酸化-S6的Western blot分析序列240/244和磷酸化-4EBP通过37/46在MDA-MB-435或MDA-MB-231对照细胞和Ndi1-表达细胞中。以β-管蛋白为蛋白质负荷对照。信号量化由红外成像（可检测波段总数）测量，并相对于对照表示，如下所示。结果代表了5个独立实验。泳道在同一凝胶上运行，但不相邻（白线）。(C类)乳腺脂肪垫肿瘤植入2.5×10后5周H&E染色及p62、Ki67或Ndi1表达5MDA-MB-435对照SCID小鼠Ndi1表达细胞。每组显示6个代表性肿瘤中的2个。原始放大倍数，×10。(D类)通过NDUFV1敲除抑制复合物I活性会影响mTORC1活性和p62消除。p62、磷酸-AKT底物、磷酸-S6的蛋白质印迹分析序列240/244和磷酸化-4EBP通过37/46，比较NDUFV1敲除与对照MDA-MB-435细胞。通过红外成像测量的信号量化（可检测波段的总数），并相对于对照表达，如下所示。结果代表了3个独立实验。Lanes在同一凝胶上运行，但不连续（白线）。
图4
图4。复合物I活性增强对转移的抑制依赖于自噬。
(A类)ATG5敲除（shATG5）抑制MDA-MB-435和MDA-MB-231对照细胞和Ndi1表达细胞的自噬，如p62和LC3BI积累所示。ATG5、p62信号和LC3BI/II比率的信号量化，通过红外成像（可检测频带总数）测量并相对于对照表示，如下所示。β-管蛋白作为蛋白质负荷控制。Lanes在同一凝胶上运行，但不连续（白线）。(B类)ATG5敲除阻断了Ndi1在MDA-MB-435和MDA-MB-231细胞中的抗转移作用。静脉注射2.5×10后7周，通过体外肺成像测量肺定植5肿瘤细胞(n个=每组8个）。方框表示四分位范围；方框内的线表示中值；胡须表示最小值和最大值*P（P）<0.05，非参数Mann-Whitney检验。(C类)ATG5敲除增强了MDA-MB-435细胞的多器官转移，并通过Ndi1逆转了转移抑制。所示为尾静脉注射2.5×10后7周每组5只代表性小鼠的无创生物发光成像5MDA-MB-435对照或Ndi1-表达细胞，有或没有ATG5敲除。
图5
图5。北美+复合物I和NAD的电平调制+合成和循环途径调节AKT/mTORC1活性、自噬和转移。
(A类)Ndi1表达增强NAD+/NADH余额。北美+/MDA-MB-435或MDA-MB-231对照组的全细胞或线粒体提取物与Ndi1表达细胞的NADH比率。Ndi1稳定NAD+/NADH比值，尤其是在葡萄糖缺乏和缺氧引起的代谢应激下。北美+/在培养48小时后，在全细胞提取物中测量应激下的NADH比率。(B类)对NAD的干扰+合成和再循环途径降低NAD+/NADH比率。敲除MDA-MB-435和MDA-MB-231细胞中的NAMPT（shNAMPT）可降低NAD+/NADH比率（在5 mM葡萄糖和常氧条件下生长48小时后的全细胞提取物）。(C类)NAMPT敲除增加MDA-MB-435和MDA-MB-231细胞的肺定植活性(n个=每组6人）。(D类)NAMPT敲除影响mTORC1活性和p62消除。p62、磷酸-AKT底物、磷酸-S6的蛋白质印迹分析序列240/244和磷酸化-4EBP通过37/46与对照细胞相比，MDA-MB-435和MDA-MB-231 NAMPT敲除。β-管蛋白作为蛋白质负荷控制。信号量化由红外成像（可检测波段总数）测量，并相对于对照表示，如下所示。Lanes在同一凝胶上运行，但不连续（白线）。结果代表了3个独立实验。(A类–C类)数据为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，未配对双尾学生t吨测试(A类和B类)或非参数Mann-Whitney检验(C类).
图6
图6。北美+前体治疗抑制转移活性。
(A类)北美+前体处理增强了NAD+/培养的MDA-MB-435和MDA-MB-231亲代细胞中的NADH比率。北美+/在完全培养基中用10 mM NIC或NAM处理细胞3天后，测量NADH水平。n个=3个独立实验。(B类和C类)北美+实验小鼠的前体治疗抑制了肺转移。MDA-MB-435在肺部定植(B类)或MDA-MB-231(C类)亲本细胞（2.5×105静脉注射）。对照组未接受任何处理（相同pH值的普通饮用水）。通过重复无创生物发光成像测量转移生长。n个=每组6人。(D类)NIC或NAM处理影响mTORC1活性和自噬。p62、磷酸-AKT底物和磷酸-S6的Western blot分析序列240/244在MDA-MB-435或MDA-MB-231亲本细胞中使用或不使用10 mM NIC或NAM治疗48小时。β-管蛋白作为蛋白质负荷控制。信号量化由红外成像（可检测波段总数）测量，并相对于对照表示，如下所示。结果代表了3个独立实验*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，未配对双尾学生t吨测试(A类)或非参数Mann-Whitney检验(B类和C类).
图7
图7。北美+原发性乳腺肿瘤切除后的前体治疗可提高动物存活率。
(A类)NAM治疗增强了NAD+/培养的4T1小鼠乳腺癌细胞中的NADH比率。北美+/在完全培养基中用10 mM NAM处理细胞2天后，测量NADH水平**P（P）<0.01，未配对双尾学生t吨测试。n个=2个独立实验。(B类)未经治疗的BALB/c小鼠4T1乳腺脂肪垫肿瘤的重量。当肿瘤体积达到300毫米时，手术切除肿瘤三数据显示手术时肿瘤重量分布并随机分组(n个=8），在开始治疗之前。方框表示四分位范围；方框内的线表示中位数；胡须表示极小值和极大值。P（P）=0.7480，非配对双尾学生t吨测试。(C类)比较NAM治疗和未治疗BALB/c小鼠在手术切除4T1乳腺脂肪垫肿瘤后的生存率的Kaplan-Meier曲线。在肿瘤切除后（指定为第0天），对小鼠进行治疗或在饮用水中加入1%NAM。n个=每组8人。P（P）=0.0386，对数秩检验。
图8
图8。北美+前体治疗抑制MMTV-PYMT小鼠的自发性乳腺癌进展。
(A类)NAM治疗（在整个实验期间，从断奶开始，饮用水中的浓度为1%）降低了乳腺肿瘤的生长。每只接受治疗的小鼠的全部10个乳腺脂肪垫的重量(n个=10），未经处理的对照小鼠(n个=11），以及未经治疗的年龄和品系匹配的PyMT-阴性小鼠（正常；n个= 3). 方框表示四分位范围；方框内的线表示中值；胡须表示最小值和最大值***P（P）<0.001，非参数Mann-Whitney检验。(B类)未经治疗和NAM治疗的PyMT小鼠的脂肪垫，代表了10个脂肪垫位置。(C类)NAM治疗抑制了PyMT诱导的乳腺癌进展。未经处理（PyMT-Ctrl）或经NAM处理（PyMT-NAM）小鼠的8个代表性脂肪垫的形态阶段的百分比面积。每组的平均值如下所示。通过形态计量学测量对H&E染色肿瘤切片的全切片扫描进行增生、腺瘤、早期和晚期癌的评分。(D类)来自4个未经治疗和NAM治疗的PyMT小鼠肿瘤的2个H&E染色切片的代表性显微视野。比例尺：200μm（每个治疗组顶行）；50μm（底行）。(E类)对照组和NAM处理的PyMT小鼠乳腺肿瘤的Western blot定量分析(n个=每组8个肿瘤）。图中显示了p62，phospho-S6的相对蛋白质丰度序列240/244和磷酸化-4EBP通过37/46.方框表示四分位范围；方框内的线表示中值；胡须表示极小值和极大值***P（P）<0.001，未配对双尾学生t吨测试。
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