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.2012年12月10日；199(6):883-91.
doi:10.1083/jcb.201208024。

Munc13控制神经元致密核小泡释放的位置和效率

Rhea van de Bospoort公司 1, 玛格丽塔·法里纳, 萨宾·K·施密茨, 阿瑟·德容, 海蒂·德维特, Matthijs Verhage公司, 路德·福·托宁
附属公司

Munc13控制神经元致密核小泡释放的位置和效率

Rhea van de Bospoort公司等。 J细胞生物学. .

摘要

神经致密核小泡（DCV）含有多种对大脑发育和功能至关重要的物质，但控制其释放的机制基本上尚不清楚。我们量化了海马神经元在单囊泡分辨率下活动依赖性DCV的释放。DCV优先在突触末端融合。DCV也在突触外部位融合，但仅在长时间刺激后。在munc13-1/2-null突变神经元中，突触DCV释放减少但未被消除，突触偏好丧失。剩下的融合需要长时间的刺激，类似于野生型神经元的突触外融合。相反，Munc13-1过表达（M13OE）促进突触外DCV释放，也无需长时间刺激。因此，Munc13-1/2促进DCV融合，但与突触小泡不同，它对DCV释放并不重要，M13OE足以产生有效的DCV突触外释放。

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数字

图1。
图1。
神经元释放DCV的光学传感器。（A） DCV释放光学报告器的示意图，该报告器允许可视化单个DCV融合事件。PM，质膜。（B） 转染Semaphorin-3a–pHfluorin（cargo-pH）的神经元的共焦图像，内源性DCV货物嗜铬粒蛋白a（ChromoA）染色显示完全重叠（箭头）。（C） 图像系列显示了一个货物-氟化物释放事件（箭头）和NH4+反应显示神经突中的所有小泡（箭头）。（D） 用信号素-3a–pHfluorin和ΔF在NH上测量DCV释放事件的ΔF归一化频率分布4+灌注（NH4+：395个点状，7个细胞；释放：293个点，30个细胞；ΔF释放中值=5.4 a.u。；中值ΔF NH4+=6.0 a.u.）。（E） 用信号素-3a–pHfluorin测量DCV释放事件的频率分布（53个细胞中570个释放事件；蓝色条，50 Hz下50个AP的16次爆发）。（F） 刺激前60 s、刺激期间和刺激后70 s期间的DCV释放事件（之前：1±0.6；期间：16±3.4；之后：5±1.3囊泡/细胞；n个=21个细胞，n个= 3). **, P<0.01。使用SEM平均值绘制数据。棒材，2µm。
图2。
图2。
虽然DCV不会在突触区域积聚，但DCV在突触处释放丰富且效率更高。（A） 突触（实心箭头）和突触外释放事件（开放箭头）的示例。Synapsin-mCherry以红色显示，发布事件以绿色显示。棒材，1µm。（B） 显示突触（左绿点）和突触外（右绿点）释放事件的卡通。（C） ΔF在NH上的频率分布叠加4+应用突触（syn）DCV puncta（synaptic 589 puncta）和突触外（e-syn）CCV putta（extrasynaptic 612 putta）。（D） NH上ΔF的个别频率分布4+应用程序。（E） 窝藏DCV的突触终末的电子显微照片。箭头指向DCV。棒材，100 nm。（F） 电子显微镜下DCV的直径（平均直径：68.9±1.0 nm，7个细胞中有146个DCV）。（G） 每个突触轮廓的DCV数量（7个细胞中有102个突触）。插图中，±22%的突触DCV与质膜对接（未对接，113；对接，33；总计146）。（H） 用信号素-3a–pHfluorin测量突触和突触外DCV释放事件的百分比（235个突触释放事件，131个突触外释放事件；n个=34个单元格，n个= 3; *, P<0.05）。（一） 每个细胞突触和突触外事件的释放事件累计数。（突触释放率：0.26±0.03囊泡/s；突触外：0.13±0.02囊泡/s）。阴影表示SEM。（J）突触和突触外事件的前四次爆发期间的累计事件数（蓝色条1、2、3和4表示50 Hz下的50个AP）。（K） 突触（红色）和突触外（黑色）释放事件的痕迹示例。箭头表示刺激的开始。数据以SEM平均值绘制。
图3。
图3。
Munc13特别减少突触处DCV的释放。（A） 用Semaphorin-3a–pHfluorin测量WT和Munc13-1/2 DKO（M13DKO）神经元每个细胞DCV释放事件的平均数（WT:482个事件，n个=41个细胞；M13DKO:108个事件，n个=23个单元格；n个=4；**，P＜0.01）。（B） 每个单元的释放事件累计数。（C） 在50 Hz下50个AP的前四次爆发期间，释放事件的累计（总和）数量。（D） 在10-s采集期间保持突触的突触定位DCV的百分比（WT:221个小泡，n个=6个单元；M13DKO:146个囊泡，n个=5个单元格；n个= 2). （E） WT和M13DKO神经元中突触和突触外DCV释放事件的百分比（WT:21细胞；M13DKO:23细胞；n个= 4; *, P<0.05；**，P＜0.01）。（F） 突触和突触外事件的总数显示突触事件的特定丢失（总事件：WT，255；M13DKO，151）。红色虚线表示酒吧高度的差异。（G） 突触DCV释放事件的累计次数。（H） 突触外DCV释放事件的累计次数。阴影代表SEM。数据以SEM平均值绘制。
图4。
图4。
M13OE增加突触外部位DCV的释放。（A） WT神经元的正常Munc13-1强度与过度表达Munc13-1的神经元（M13OE，n个= 3; **, P<0.001）。（B） 带有内源性Munc13-1的WT神经元和过度表达Munc13-1WT神经元的共焦图像（箭头显示Munc13的突触定位）。棒材，2µm。（C） 突触定位的DCV保持突触10秒的百分比（WT:199个小泡，n个=7个单元；M13OE:170个小泡，n个=7个单元格）。（D） 每个细胞DCV释放事件的平均数（WT:36个细胞发生361次事件；M13OE:32个细胞发生588次事件；n个= 3; *, P<0.05）。（E） 每个细胞的累积（累计）DCV释放事件。（F） 在50 Hz下50个AP的前四次爆发期间释放事件的累计数量。（G） 突触和突触外DCV释放事件的百分比（**，P<0.01；*，P<0.05）。（H） 突触和突触外DCV释放事件的总数。突触偏好的丧失是由M13OE中突触外释放事件的增加引起的。红色虚线表示钢筋高度的差异。（一） 累积突触外DCV释放事件。（J） 突触外部位前四次爆发期间的累计事件数。（K） 累积突触DCV释放事件。（五十） 前四次突触爆发期间的累计事件数。阴影代表SEM。数据以SEM平均值绘制。
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