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.2012年12月14日；287(51):43071-82.
doi:10.1074/jbc。M112.364513。 Epub 2012年10月26日。

ADAM17（一种去整合素和金属蛋白酶17）与硫氧还蛋白-1新型相互作用的鉴定

安尼泽·阿拉戈 1, 玛丽亚·路易莎·诺盖拉, 丹妮拉·格拉纳托, 费尔南多·西蒙布科, 罗德里戈五世·霍诺拉托, 扎伊拉·霍夫曼, 萨米·洋秀, 弗朗西斯科·劳林多, 法比奥·M·斯金纳, 安娜·卡罗莱纳·M·泽里, 保罗·S·L·奥利维拉, 尼古拉斯·谢尔曼, 阿德里亚娜·佩斯·莱姆
附属公司

ADAM17（一种去整合素和金属蛋白酶17）与硫氧还蛋白-1新型相互作用的鉴定

Annelize Z B Aragáo公司等。 生物化学杂志. .

摘要

ADAM17，也称为TNFα转化酶，是EGF受体配体的主要脱辅酶，被认为是负责表面蛋白外结构域脱落的主要蛋白酶之一。具有细胞外催化结构域的膜锚定蛋白酶如何通过内外调节被激活尚不完全清楚。我们将硫氧还蛋白-1（Trx-1）作为ADAM17细胞质结构域的一个伴侣，该结构域可能参与ADAM17活性的调节。我们在HEK293细胞中诱导了ADAM17胞质结构域的过度表达，并且在蛋白免疫沉淀后通过MS鉴定了能够结合该结构域的配体。通过免疫印迹、免疫定位和固相结合测定，Trx-1也被验证为ADAM17细胞质结构域和全长ADAM17重组蛋白的配体。此外，利用核磁共振技术，体外研究表明，ADAM17细胞质结构域的滴定促进了Trx-1构象的变化。交联复合物的MS分析表明，赖氨酸残基使两种蛋白质交联。为了进一步评估Trx-1的功能作用，我们使用了肝素结合EGF脱落细胞模型，并观察到在HEK293细胞中Trx-1过度表达可以降低由佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐或EGF激活的ADAM17的活性。本研究确定Trx-1是ADAM17胞质结构域的一种新的相互作用伙伴，并表明Trx-1可能参与ADAM17活性调节。

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数字

图1。
图1。
硫氧还蛋白-1是ADAM17的新配体。用FLAG-ADAM17细胞转染HEK293细胞；48小时后收集细胞内蛋白并提交给IP，然后进行MS和免疫印迹(IB公司).A类，三个面板中的第一个显示了FLAG标记的ADAM17细胞质域的IB和IP确认蛋白表达后的阴性对照。然后显示了在这两种条件下蛋白质裂解物的输入和内源性Trx-1的检测。最后，通过IB证实了Trx-1与FLAG-ADAM17细胞的相互作用。箭头指示Trx-1带的识别，以及星号表示不特定的带。这个下部面板显示全长ADAM17-HA的表达及其IB的阴性对照。还表明内源性Trx-1通过IP和IB与全长ADAM17-HA相互作用。B类，Trx-1肽的手动验证，包含b和y离子系列的光谱。C类，共聚焦免疫荧光证实内源性Trx-1和全长ADAM17-HA之间的共定位(上部面板)以及可能的内源性Trx-1和FLAG-ADAM17细胞(下部面板)在HeLa细胞中。保护G，蛋白质G。
图2。
图2。
人工验证ADAM17细胞质域的磷酸化位点。MS分析显示ADAM17细胞质残基磷酸化：Ser791和Ser819手动注释含有b和y离子系列的光谱，以验证Ser（P）791(A类)和Ser（P）819(B类).
图3。
图3。
ADAM17胞质结构域和Trx-1重组蛋白可以以浓度依赖的方式相互作用。使用Trx-1或ADAM17细胞重组蛋白进行固相结合分析。A类，纳米摩尔浓度的His-FLAG-ADAM17细胞（0–16 n米)培养以固定His-Trx-1-HA。B类，His-Trx-1-HA的纳米摩尔浓度（0.5–16 n米)培养固定His-FLAG-ADAM17细胞。两种孵育均在室温下进行2小时。阴性对照组的重组蛋白浓度相同，但没有平板涂层。两个实验一式三份。
图4。
图4。
核磁共振显示ADAM17胞质结构域和Trx-1-HA重组蛋白相互作用。 A类,15Trx-1重组蛋白25°C下的N-HSQC光谱(黑色)以50:1的比例用ADAM17细胞质域滴定(青色), 25:1 (蓝色), 10:1 (绿色), 5:1 (洋红), 1:1 (黄色的)和1:2(红色). 检测到一些峰的化学位移有微小变化(插入，*），表示蛋白质之间的相互作用。B–H型分别表示峰值1、2、3、4、5、6和7的变焦。
图5。
图5。
ADAM17胞质结构域与Trx-1的相互作用。 A类纯化的重组蛋白Trx-1和ADAM17胞质结构域被孵育、化学交联、用胰蛋白酶消化并用MS进行分析。手动验证α（ADAM17细胞质结构域肽）和β（Trx-1肽）链的b和y离子系列的MS/MS谱。B类，自定义对接算法的结果显示了低能值与交联可接受距离之间的关系。C类，基于交联距离和能量值的最佳构象。ADAM17胞质结构域着色绿色中描述了Trx-1蓝色.DSS显示在范德瓦尔斯表示中(黄色的)，Trx-1的催化域如所示红色.D，Trx-1和ADAM17细胞质结构域复合物的10ns模拟的RMSD图。这个红线代表整体RMSD，以及黑线表示ADAM17cyto和总Trx-1之间的相对RMSD。E类，通过10-ns分子动力学模拟对ADAM17细胞的单个残基贡献进行归一化箱形图。大于零的值表示复杂结合能的高贡献，应针对点突变。
图6。
图6。
硫氧还蛋白-1在PMA刺激下调节HEK293细胞中HB-EGF的脱落。用Trx-1重组蛋白瞬时转染稳定表达HB-EGF-AP的HEK293细胞。48小时后，将细胞饥饿4小时，然后激活PMA 1小时。收集上清液并通过AP分析进行评估。A类AP报告试验表明，Trx-1可减少PMA处理后HEK293细胞中HB-EGF的脱落。三个独立实验重复进行（单向方差分析，然后进行Tukey检验。不同字母表示第页< 0.05).B类实时定量PCR证实了在相同实验条件下瞬时转染后Trx-1-HA的表达。C类碱性磷酸酶活性在HEK293细胞富集稳定表达HB-EGF-AP和瞬时表达Trx-1-HA的膜蛋白后间接显示HB-EGF的表达。碱性磷酸酶底物带的密度测定如右侧面板。D类实时定量PCR也证实了HB-EGF和Trx-1在HEK293细胞中的表达。E类和F类Trx-1表达的增加不会改变ADAM17 mRNA水平(E类)可能是HEK293细胞膜蛋白富集后的proADAM17及其成熟形式(F类).克，为了确认ADAM17是负责PMA诱导HB-EGF裂解的sheddase，WT和亚当17−/−用编码HB-EGF-AP的载体瞬时转染mEF细胞，并用PMA激活。计算上清液AP活性与细胞裂解液和三个相同制备孔上清液中的总AP活性之间的AP比率，并取平均值（3）。三个独立实验一式三份（对选定的柱对进行单向方差分析，然后进行Bonferroni检验）。*，统计差异第页< 0.05.
图7。
图7。
在EGF的生理刺激下，硫氧还蛋白-1调节HEK293细胞中HB-EGF的脱落。用Trx-1-HA瞬时转染稳定表达HB-EGF-AP的HEK293细胞。48小时后，将细胞置于饥饿期4小时，然后激活EGF 1小时。收集上清液并通过AP报告试验进行评估。结果表明，Trx-1对EGF刺激下HB-EGF的脱落具有负调节作用。三个独立实验一式三份（单向方差分析，然后是Tukey检验；不同信件显示统计差异第页< 0.05).
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