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.2012年4月18日；32(16):5654-66.
doi:10.1523/JNEUROSCI.0455-12.2012。

神经源性脑室下区干/祖细胞在其活动但非静止状态下依赖Notch1

奥努尔·巴萨克 1, 克劳迪奥·贾奇诺, 艾玛·菲奥里尼, H罗布森·麦克唐纳, 威尔登·泰勒
附属公司

神经源性脑室下区干/祖细胞在其活动但非静止状态下依赖Notch1

奥努尔·巴萨克等。 神经科学. .

摘要

成年哺乳动物的前脑含有神经干/祖细胞（NSC），它们在一生中产生神经元。与其他体干细胞系统一样，神经干细胞主要处于静止状态，只是偶尔增殖，以产生更稳定的后代。然而，最近研究表明，静止状态并不是干细胞的基本标准。目前尚不清楚神经干细胞是否根据其增殖状态表现出分子依赖性的差异。成年小鼠脑室下区（SVZ）通过激活NSC具有显著的修复能力。在神经发生或再生过程中控制成年神经干细胞的分子相互作用尚不清楚，但解决这些相互作用对于理解大脑内稳态和修复至关重要。利用条件遗传学和命运图，我们表明Notch信号对SVZ的神经发生至关重要。通过马赛克分析，我们发现了活跃神经原性和再生性神经干细胞之间Notch依赖性的惊人差异。虽然主动和再生NSC都依赖于规范的Notch信号，但Notch1缺失会导致主动NSC（aNSC）的选择性丢失。与之形成鲜明对比的是，静态神经干细胞（qNSC）在Notch1消融术后保持不变，直到在再生或老化过程中被诱导，从而成为Notch1依赖性细胞，无法完全恢复神经再生。我们的结果表明Notch1是成人SVZ生态位的关键组成部分，促进aNSC的维持，并且这种功能在qNSC中得到补偿。因此，我们证实了Notch信号对维持成年SVZ中NSC和神经发生的重要性，并揭示了NSC对Notch1的选择性依赖，这可能是由有丝分裂状态决定的。

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数字

图1。
图1。
Notch1在成人心室下区壁龛中表达。A类，SVZ和细胞型特异性标记表达的示意图（改编自Doetsch等人，1999b）。SVZ中参与成年神经发生的细胞的层级组织。aNSC很少分裂并产生TAP，而TAP反过来又产生成神经细胞。静态再生神经干细胞对信号（包括损伤）作出反应，进入细胞周期，并产生神经原性神经干细胞。目前尚不清楚aNSC和再生qNSC是否是同一细胞的独立状态，以及NSC是否可以在两者之间穿梭。条纹黄核分裂缓慢，BrdU保留NSC；黄色细胞核是有丝分裂活跃的细胞。B类，低放大率共焦光学切片，显示前脑心室侧壁的概览图像，包括SVZ。C类，Notch1蛋白与GFAP（箭头）共分布，但也由GFAP表达−单元格（箭头）。中截面的高倍图像B类.D类、GFAP+SVZ星形胶质细胞表达Notch1，包括假定的NSC，突起与侧脑室接触（箭头）并交叉指入室管膜衬里。E类、一些星形胶质细胞（GFAP+)处于细胞周期（PCNA+，箭头），有些不是（GFAP+PCNA公司−，打开箭头）。SVZ星形胶质细胞的Notch1水平低于成簇的假定成神经细胞（箭头所示）。F类、神经源性TAP（Ascl1+)表示与其他SVZ单元格（箭头）类似的Notch1（箭头）。G公司，Dcx+成神经细胞（箭头）也表达Notch1（Nyfeler等人，2005年）。Str，纹状体；CC，胼胝体。比例尺：B类，100微米；D–G型，20微米。
图2。
图2。
槽口1消融减少了RMS中成神经细胞的数量和所有OB层中新生神经元的数量。A类，floxed的方案槽口1基因座（外显子I两侧LoxP公司站点）和嵌套：：creERT2段分析中使用的等位基因（Giachino和Taylor，2009）。用TAM诱导成年小鼠10天，然后追逐15或45天（死亡，箭头）。在红条水平（OB和近端RMS）的冠状切片上分析大脑。OB的示意图显示远端RMS（dRMS）、颗粒细胞（Gr）和肾小球细胞层（GC）。B类,C类，bGal+Dcx公司+近端RMS（pRMS）的成神经细胞（箭头）减少槽口1cKO（槽口1Δ/Δ)与对照（缺口1+/+)TAM治疗后15天。D类，bGal的量化+RMS中的成神经细胞槽口1cKO（槽口1Δ/Δ;n个=3）和控制（切口1+/+;n个=4）TAM治疗后15天和45天的动物。bGal的生产+成神经细胞在第15天减少，并且在槽口1cKO动物。E类,F类，bGal+Dcx公司+RMS后部的成神经细胞（箭头）减少槽口1cKO（槽口1Δ/Δ)与对照（缺口1+/+)TAM治疗后45天。G–L，bGal+两个控制（Notch1）OB中的单元格+/+)以及槽口1cKO（槽口1Δ/Δ)老鼠是NeuN+神经元（箭头）。米,N个，烧蚀槽口1TAM治疗后45天，OB中新生成的神经元数量显著减少（X-Gal染色为蓝色）。插页显示了相应部分的DAPI染色。哦,P（P）颗粒细胞中重组细胞的定量(哦)和肾小球细胞层(P（P）)控制OB（切口1+/+;n个分别=3和8）和槽口1cKO（槽口1Δ/Δ;n个分别为3和6）小鼠。错误栏是SD。学生的t吨测试*第页< 0.05. 比例尺：B类,C类,E–G公司,我,K（K），20微米；米,N个，100微米。
图3。
图3。
槽口1消融导致SVZ祖细胞持续丢失。A类，成年小鼠TAM诱导方案，然后进行15或45天追逐（死亡，箭头）。在红条水平上对SVZ冠状切片上的大脑进行分析。B类,C类，bGal+PCNA公司+增殖细胞（箭头）和成神经细胞（bGal+Dcx公司+)在SVZ中丢失槽口1cKO小鼠（Notch1Δ/Δ;C类)与控制（切口1+/+;B类)TAM治疗后15天。D类,E类、增殖细胞丢失（bGal+PCNA公司+; 箭头）和成神经细胞（bGal+Dcx公司+)在的SVZ中槽口1cKO小鼠（Notch1Δ/Δ;E类)与控制（切口1+/+;D类)甚至重组后45天。F类，bGal的量化+PCNA公司+SVZ中的增殖细胞和成神经细胞槽口1cKO（槽口1Δ/Δ;n个= 3–4),RBP-J型cKO（RBP-JΔ/Δ;n个=3）和控制（RBP-J+/+槽口1+/+;n个=3-4）只动物。G公司，稀疏重组可以对嵌套：：creERT2段-表达NSC（bGal+)包括增殖细胞（bGal、PCNA+; 箭头）。小时，bGal+成神经细胞[双皮质激素（Dcx+)]在RMS中是群集的，与具有共同来源一致。我、重组增殖细胞簇和bGal数量的量化+PCNA公司+中每个簇的单元数槽口1cKO（槽口1Δ/Δ;n个=6）和控制（切口1+/+;n个=7）动物。每6.25×10重组簇的概率5微米三SVZ的。错误栏是SD。学生的t吨测试*第页<0.05时**第页< 0.001. 比例尺，20μm。
图4。
图4。
槽口1消融不会导致GFAP的丢失+国家科学委员会。A类，成年小鼠的10天TAM诱导方案，然后进行0、15或45天的追逐（死亡，箭头）。在红条水平的冠状切片上分析大脑。B类，烧蚀槽口1对bGal的总数没有显著影响+第0天的细胞。槽口1cKO（槽口1Δ/Δ;n个=3）和控制（切口1+/+;n个=3）动物。C类，与针对早期祖细胞一致，少量细胞群为bGal+对照动物SVZ室管膜下层（Notch1+/+). 大多数靶细胞（bGal+)表达干细胞标记GFAP的细胞处于静止状态（PCNA−，箭头）。D类，bGal+SVZ室管膜下层的细胞槽口1cKO动物（缺口1Δ/Δ)仍然表示GFAP（箭头）。E类,槽口1消融不会改变bGal的数量+表达GFAP的细胞+SVZ室管膜下层和bGal增殖（PCNA）+GFAP公司+细胞也没有增加。相反，RBP-J型消融（RBP-JΔ/Δ)导致bGal降低+GFAP公司+室管膜下细胞。槽口1cKO（槽口1Δ/Δ;n个=第15天为3，第45天为4），RBP-J型cKO（RBP-JΔ/Δ;n个=3）和控制（RBP-J+/+槽口1+/+;n个＝第15天的7只和第45天的4只）动物。F类，bGal+TAM治疗后立即在对照小鼠中细胞很少表达TAP标记物Ascl1（第0天：Notch1+/+; 箭头）。G公司，Ascl1+重组细胞在槽口1cKO小鼠，并且没有增加（Notch1Δ/Δ，箭头）。小时，烧蚀槽口1对bGal的数量没有显著影响+Ascl1公司+d0处的TAP。槽口1cKO（槽口1Δ/Δ,n个=3）和控制（切口1+/+,n个=3）动物。错误栏是SD。学生的t吨测试*第页< 0.05. 比例尺，10μm。
图5。
图5。
Notch1是SVZ中神经原祖细胞再生所必需的。A类，实验范式和再生过程的示意图概述。槽口1液氧/液氧在颅内输注阿糖胞苷前，用TAM诱导和对照组大鼠10天。在再生的前5天，用BrdU处理小鼠。在冠状切片上对大脑进行分析，分析水平如红色条所示。B类，bGal+休眠的NSCs在AraC诱导的变性后激活，并通过产生新生bGal促进SVZ的再生+Dcx公司+成神经细胞（箭头）。C类，bGal+细胞在再生的SVZ中减少槽口1cKO（槽口1Δ/Δ)动物。室管膜层在槽口1cKO甚至在AraC治疗后（箭头所示）。D类，bGal的量化+神经母细胞+)在的再生SVZ中槽口1cKO（槽口1Δ/Δ;n个=4）和控制（切口1+/+;n个=4）动物。E类，bGal+NSC产生增殖子代集群（bGal+PCNA公司+，箭头）+/+).F类，bGal+PCNA公司+细胞在再生的SVZ中减少槽口1cKO（槽口1Δ/Δ)动物（箭头）。G公司，bGal的量化+增殖细胞+)在的再生SVZ中槽口1cKO（槽口1Δ/Δ;n个=4）和控制（切口1+/+;n个=4）动物。错误栏是SD。学生的t吨测试*第页< 0.05. 比例尺：B类,C类，20微米；E类,F类，10微米。
图6。
图6。
槽口1消融导致GFAP减少+再生SVZ和老化过程中的休眠NSC。A类,B类，bGal+停输阿糖胞苷15天后再生SVZ中的细胞（箭头）减少槽口1-烧蚀（缺口1Δ/Δ)与对照（缺口1+/+)动物。C类，烧蚀槽口1（槽口1Δ/Δ;n个=5）再生导致bGal减少之前+GFAP公司+与对照组比较的单元格（Notch1+/+;n个=5）动物。D类,E类，对照组再生SVZ中存在BrdU标签染色细胞（Notch1+/+)以及槽口1cKO（槽口1Δ/Δ)动物和一些表达GFAP（箭头）。F类，bGal+删除Notch1（Notch1）后，再生SVZ中BrdU保留细胞略有减少Δ/Δ;n个=5）与对照（缺口1+/+;n个=5）动物。G公司，bGal的数量+GFAP公司+BrdU保留细胞在再生的SVZ中略有减少槽口1cKO（槽口1Δ/Δ;n个=5）与对照（缺口1+/+;n个=5）动物。b加仑+GFAP公司+中的单元格槽口1cKO SVZ不保持有丝分裂活性（PCNA+)再生后。小时,我，在控制和槽口1cKO动物+细胞恢复到静止状态（PCNA−)在重新生成的SVZ中（箭头）。J型，在成年小鼠中进行为期10天的TAM诱导方案，随后进行为期12个月的追逐（死亡，箭头）。K–M公司，幼年成年小鼠中Notch1的消融（Notch1Δ/Δ;n个=4）导致bGal减少+GFAP公司+1年后分析的细胞与对照小鼠（Notch1+/+;n个= 4). 错误栏是SD。学生的t吨测试*第页< 0.05. 比例尺：A类，25微米；D类,E类,小时,我,K（K）,L（左），10微米。
图7。
图7。
Notch2和Notch3在SVZ中以与Notch1类似的模式表示。A类，通过GFAP在成年小鼠SVZ中表达Notch1+和总建筑面积−细胞。B类,C类，连续部分用抗缺口2染色(B类)或anti-Notch3(C类)SVZ中的抗体表现出与Notch1相似的表达模式。D类，Notch2通过GFAP表达−SVZ室管膜下区的细胞以及GFAP+SVZ星形胶质细胞和推测的NSC靠近侧脑室或与侧脑室接触。E类，一些缺口2+GFAP公司−细胞是双皮质素+（Dcx+)成神经细胞。F类,G公司，GFAP显著表达Notch3+SVZ星形胶质细胞。比例尺：A–C，100微米；D–G型，20微米。
图8。
图8。
SVZ稳态和再生的Notch1调节模型。Notch1在成年NSC人群中的作用。成人SVZ的持续神经发生由aNSC维持，其分裂缓慢（黄色条纹核）。aNSC依赖Notch1进行维持、自我更新和神经发生；如果没有Notch1，这些aNSC就会受到损害。快速分化的TAP（黄色核）表达Notch1，并产生迁移至OB并生成神经元的成神经细胞。qNSC依赖RBP-J而非Notch1进行维持，并在损伤后进入细胞周期，成为再生的驱动力。Notch1缺失后aNSC的选择性丢失表明Notch1在稳态神经发生中起着不可补偿的作用。在缺乏Notch1的情况下，活化的NSCs无法自我更新并有效恢复成人神经发生，导致qNSCs减少和aNSCs损失。在完整的大脑中，qNSCs不容易在状态之间转移，但在再生过程中，qNSCs进入细胞周期并呈现出aNSC Notch1依赖状态。RBP-J阻断qNSC的细胞周期进入并促进NSC的维持。慢/快：细胞分裂的速度。
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