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.2012年4月1日；302（7）：H1394-409。
doi:10.1152/ajpheart.00584.2011。 Epub 2012年1月13日。

氯化血红素通过促进脂质过氧化导致内皮细胞线粒体功能障碍：自噬的保护作用

阿什利·希格登 1, 格洛丽亚·贝纳维德斯, 巴鲁·查科, 小森欧阳, 米歇尔·约翰逊, 艾梅·兰德尔, 张建华, 维克多·M·达利-美国
附属公司

氯化血红素通过促进脂质过氧化导致内皮细胞线粒体功能障碍：自噬的保护作用

阿什利·N·希格顿等。 美国生理学杂志心脏循环生理学. .

摘要

红细胞溶血和肌肉损伤导致血红素蛋白、肌红蛋白、血红蛋白和游离血红素释放到血管系统中。血红素毒性的机制尚不清楚，但可能涉及脂质过氧化，我们推测这可能导致内皮细胞线粒体损伤。为了测试这一点，我们使用培养的牛主动脉内皮细胞（BAEC），并将其暴露于氯化血红素。氯化血红素导致线粒体功能障碍、自噬激活、有丝分裂以及高浓度的细胞凋亡。为了检测氯化血红素是否诱导脂质过氧化和损伤蛋白质，我们使用了标记有生物素或Bodypy（Bt-AA，BD-AA）的花生四烯酸衍生物。我们发现，在用氯化血红素处理的细胞中，Bt-AA被氧化，并与蛋白质形成加合物，这些加合物被α-生育酚抑制。血红素依赖性线粒体功能障碍也被α-生育酚减弱。蛋白质巯基修饰和羰基形成发生在暴露时，不受α-生育酚的抑制。抑制剂3-甲基腺嘌呤增强了细胞死亡，支持自噬的保护作用。这些数据表明，氯化血红素通过一种机制介导细胞毒性，该机制涉及氧化脂质和其他氧化剂对蛋白质的修饰、呼吸能力的降低以及对自噬过程的保护作用。减轻脂质过氧化可能能够保护内皮细胞的线粒体功能，并保护细胞免受血红素依赖性毒性的影响。

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数字

图1。
图1。
海明可导致细胞凋亡并降低牛主动脉内皮细胞（BAEC）的线粒体膜电位。A类：使用乳酸脱氢酶（LDH）释放试验测定用氯化血红素处理24小时的BAEC中的细胞死亡。B类：在氯化血红素治疗4或24小时后，使用（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物）（MTT）测定法测定细胞活力。C类：使用经氯化血红素处理4小时的BAEC裂解物的免疫印迹检测caspase 9（pro和cleaved）和cleavedcaspase 3。D类：血红素加氧酶-1（HO-1）蛋白水平，使用血红素处理细胞4h后BAEC裂解物的免疫印迹测定。E类,正确的：在BAEC中用血红素处理30min或4h后，通过5,5′，6,6′-四氯-1,1′，3,3′-四乙基苯并咪唑基碳菁碘化物（JC-1）荧光测定血红素对线粒体膜电位的影响。E类,左边：用氯化血红素处理2小时后，测定BAEC中的ATP含量。在收集裂解物之前，用二甲基亚砜（载体对照）或10-50μM氯化血红素处理BAEC 2小时。根据内标物用HPLC分析裂解液，以量化ATP的量*P（P）与对照组相比<0.05；n个≥ 3. AU，任意单位#P（P）≤0.05 vs.10µM氯化血红素。
图2。
图2。
氯化血红素损害细胞生物能量学。依次添加试剂寡霉素（O）、FCCP（F）和抗霉素A（A），以测定氯化血红素对特定线粒体功能参数的影响。寡肌球蛋白被用作ATP合成酶的抑制剂。FCCP是一种线粒体解偶联剂，用于诱导通过线粒体的最大耗氧量。抗霉素a是复合物III的抑制剂，用于抑制电子传递链，以便测定与呼吸链相关的耗氧量。A类：用氯化血红素处理BAEC 3 h，然后在分析培养基中进行1 h平衡（因此，在首次接触氯化血红蛋白后4 h进行分析）。之后，使用细胞外通量分析仪测量耗氧量，详见方法显示了具有代表性的BOFA分析。B类：氯化血红素治疗后BAEC的基础耗氧量。C类：质子泄漏导致的氧气消耗。D类：与ATP相关的耗氧量。E类：使用FCCP刺激耗氧量确定的最大耗氧量。F类：氧气消耗归因于备用容量。G公司：非线粒体耗氧量*P（P）与对照组相比<0.05；n个≥ 3.
图3。
图3。
氯化血红素在凋亡信号之前诱导线粒体功能障碍。A类：在免疫印迹法测定caspase 9之前，用25μM氯化血红素处理BAEC 0–4 h。B类：注射25μM氯化血红素后进行BOFA分析。所示的痕迹来自一项实验，其中注射了氯化血红素（箭头以“H”表示），并测量了注射氯化血红蛋白后3小时的基础耗氧量。在测定结束时，注射化合物寡霉素（O）、FCCP（F）和抗霉素A（A）以测定线粒体功能参数。同样的方案也适用于血红素注射后0.5、1和2小时注射O、F和A（如虚线所示，数据未显示）。利用这些数据，在25μM氯化血红素治疗后的每个时间点（0.5、1、2和3 h）测定线粒体参数。C类：注射后0.5、1、2和3 h在DMSO载体处理的对照细胞（○）和25μM氯化血红素（■）中测量的ATP-相关耗氧量。D类：质子泄漏。E类：最大耗氧量（FCCP刺激率）。F类：备用容量*P（P）与对照组相比<0.05；n个≥ 3.
图4。
图4。
氯化血红素通过氧化脂质诱导蛋白质修饰，抗氧化预处理抑制氯化血红蛋白的细胞毒性。A类：用α-生育酚预处理BAEC 1 h，然后用氯化血红素应激4 h。通过用链霉亲和素HP探测的免疫印迹法探测生物素部分上的蛋白质，观察反应性脂质种类。显示了具有代表性的Western blot图像。B类：来自3个免疫印迹的信号定量。C类：用抗氧化剂预处理1小时，用氯化血红素处理16小时后，用MTT法测定BAEC的活性*P（P）与对照组相比<0.005#P（P）<0.005 vs.仅氯化血红素；n个≥ 3.
图5。
图5。
氯化血红素诱导氧化蛋白修饰。A类：BAEC用二甲基亚砜载体（•）或α-生育酚（□）预处理1 h，然后用氯化血红素应激4 h。然后用BODIPY-肼处理细胞，详见方法用台风荧光成像仪扫描凝胶内荧光，观察羰基加合物。B类：使用ImageQuant软件测定加合物的定量。C类：用α-生育酚预处理BAEC 1 h，然后用氯化血红素胁迫4 h。用BODIPY-IAM培养裂解产物，并用SDS-PAGE分离。显示了典型的凝胶内荧光图像。D类：总反应蛋白硫醇的定量*P（P）与对照组相比<0.05#P（P）<0.05，仅与氯化血红素相比；n个= 3.
图6。
图6。
氯化血红素处理后，BODIPY花生四烯酸（BD-AA）的氧化产物定位于线粒体。A类：BAEC在成像前用10μM BD-AA和25μM氯化血红素处理2 h。用低血清培养基冲洗细胞并用丝裂原追踪红染色。显示2小时后BAEC的共焦图像，用于BODIPY和丝裂原跟踪红荧光成像。箭头表示放大的字段区域底部.B类：BAEC用10 nM线粒体靶向抗氧化剂Mito-Q预处理1 h，然后用氯化血红素处理4 h。使用BODIPY部分的凝胶内荧光对蛋白质加合物进行可视化。C类：所有波段的总BODIPY荧光强度的定量*P（P）与对照组相比<0.05#P（P）<0.05，仅与氯化血红素相比；n个= 3.
图7。
图7。
氯化血红素处理后，线粒体蛋白质被氧化脂质修饰。A类：线粒体分离纯度验证。用洋地黄素渗透细胞，然后进行nagarse处理。完整的线粒体蛋白定位于高速颗粒。未使用洗涤剂（a）、仅使用洋地黄素（b）和用β-肌动蛋白特异性抗体探测的洋地黄/甘草素（c）中显示了裂解物和线粒体部分的蛋白质印迹。B类：柠檬酸合成酶，通过生成硫代硝基苯甲酸盐进行测量。C类：LDH活性测量340 nm处NADH的氧化速率。D类：具有LAMP-1、电压依赖性阴离子通道（VDAC）、细胞色素亚基1特异性抗体的全细胞裂解物（C）和线粒体（M）组分的蛋白质印迹c（c）氧化酶和MnSOD。E类：在添加氯化血红素之前，用100µMα-生育酚预处理BAEC 1 h。用10µM BD-AA和25µM氯化血红素处理4 h后，从BAEC中分离出线粒体部分。显示了由SDS-PAGE分离的线粒体组分的BODIPY信号的典型凝胶内荧光显示。F类：BODIPY荧光定量标准化为VDAC（线粒体标记蛋白）的量。数据表示平均值±SE；n个= 3. *P（P）≤0.002 vs.全细胞裂解物**P（P）≤0.006 vs.BD-AA单独#P（P）<0.05 vs.BD-AA+氯化血红素。
图8。
图8。
VDAC被活性脂类修饰。用10μM生物素化花生四烯酸（Bt-AA）和25μM氯化血红素处理细胞4 h。用中性粒细胞生成素树脂将与生物素结合的蛋白质拉下。A类：用VDAC特异性抗体检测裂解物、流通物和下拉物组分的Western blot。B类：与VDAC对应的带强度量化。数据表示平均值±SE；n个= 3. *P（P）与Bt-AA治疗组相比，<0.05。
图9。
图9。
维生素E（Vit E；α-生育酚）可减轻BAEC中氯化血红素引起的线粒体功能障碍。在25μM氯化血红素（4 h）之前，用100μMα-生育酚（1 h）处理BAEC。A类：用无缓冲DMEM清洗BAEC以去除处理试剂，并使用XF24细胞外通量分析仪测量随时间变化的耗氧量。B类：基础耗氧量。C类：质子泄漏导致的耗氧率。D类：使用FCCP刺激率确定的最大OCR。E类：根据各组的基本OCR率和最大OCR率之间的差异计算的储备容量*P（P）<0.005对照组与氯化血红素治疗组#P（P）<0.05维生素E+血红素与仅血红素相比；n个=每组3至4人。
图10。
图10。
氯化血红素增加BAEC中自噬体的积累。用25μM氯化血红素处理BAEC 1、2或4小时。A类：用抗微管相关蛋白1轻链（LC）3抗体进行Western blot检测。以LC3-II与LC3-I之比表示的带强度量化*P（P）与对照组相比<0.05；n个= 3.B类：绿色荧光蛋白（GFP）-LC3转染的BAEC经DMSO对照物处理3小时（a）、25μM氯化血红素处理3 h（b）或10μM氯喹（阳性对照）处理5小时（c）后的共焦显微镜观察。箭头表示细胞正在自噬。C类：用mCherry-LC3转染BAEC，然后在10μM BD-AA存在下用25μM氯化血红素处理3 h。通过共焦显微镜对细胞成像。显示了具有代表性的图像。
图11。
图11。
氯化血红素增加BAEC的有丝分裂。A类：用红色荧光蛋白（RFP）-丝裂原转染BAEC，然后用GFP-LC3转染。实验前24小时将BAEC转移到玻璃盖玻片上成像。用二甲基亚砜载体或25μM氯化血红素处理BAEC 3.5 h。用共焦荧光显微镜对活细胞成像。箭头表示正在进行有丝分裂的细胞。B类：用0–50μM氯化血红素和1 mM共处理24小时后进行LDH测定。C类：用1 mM 3-甲基腺嘌呤（3-MA）和0-50μM氯化血红素共同处理BAEC中的LDH测定3 h。处理后，去除含有化合物的培养基，并允许细胞在低血清培养基中再培养24 h，然后再进行测定*P（P）<0.05，仅与氯化血红素相比。
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