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.2011年12月；179(6):2835-44.
doi:10.1016/j.ajpath.2011.08.041。 Epub 2011年10月18日。

前列环素合酶的酪氨酸硝化与糖尿病视网膜细胞凋亡增强相关

邹明辉 1, 李洪亮, 何朝勇, 林明凯, 蒂莫西·莱昂斯, 谢忠林
附属机构

前列环素合酶的酪氨酸硝化与糖尿病视网膜细胞凋亡增强相关

邹明辉等。 美国病理学杂志. 2011年12月.

摘要

糖尿病视网膜病变的风险与氧化应激和毒性二十烷酸的存在有关。然而，氧化应激是否真的通过产生有毒二十烷酸类化合物而导致糖尿病视网膜病变尚不清楚。本研究的目的是确定前列环素合成酶（PGIS）的酪氨酸硝化是否在体内外导致视网膜细胞死亡。人类视网膜周细胞暴露于高度氧化和糖化的低密度脂蛋白（HOG-LDL），但非天然形式的低密度脂肪酶（N-LDL）24小时后，周细胞凋亡显著增加，伴随着PGIS的酪氨酸硝化增加和PGIS活性降低。抑制血栓素受体或环氧合酶-2可显著减弱HOG-LDL诱导的细胞凋亡，但不恢复PGIS活性。给药超氧化物歧化酶（清除超氧化物阴离子）或L-N（G）-硝基精氨酸甲酯（L-NAME，一种非选择性一氧化氮合酶抑制剂）可恢复PGIS活性并减弱周细胞凋亡。在秋田小鼠视网膜中，糖尿病增加了视网膜内氧化低密度脂蛋白和糖化低密度脂蛋白的水平，诱导了PGIS硝化，增强了细胞凋亡，并损害了血视网膜屏障功能。长期服用天妇罗（一种超氧物清除剂）可降低视网膜内氧化低密度脂蛋白和糖化低密度脂素水平、前列腺素IS硝化作用和视网膜细胞凋亡，从而保持血-视网膜屏障的完整性。总之，氧化低密度脂蛋白介导的PGIS硝化和相关的血栓素受体刺激可能在糖尿病视网膜病变的发生和发展中起重要作用。

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数字

图1
图1
HOG-LDL诱导iNOS并增加超氧化物和NO生成。答：人视网膜周细胞与HOG-LDL（100μg/mL）和N-LDL孵育24小时。使用抗iNOS抗体通过Western blotting分析细胞裂解物。所示的斑点是来自三个不同实验的斑点的代表(*P（P）与对照组或N-LDL相比<0.05）。B类：通过测量亚硝酸盐水平测定NOS活性(*P（P）与对照组或N-LDL相比<0.05；†P（P）<0.05 vs.HOG-LDL；n个= 4).抄送：HOG-LDL增加ROS的释放。汇合周细胞暴露于HOG-LDL（100μg/mL）3小时，通过检测DCF荧光测定ROS(*P（P）与对照组或N-LDL相比<0.01；n个= 3).D类和电子邮箱：3-硝基酪氨酸修饰蛋白通过Western分析使用特定抗体进行检测，并相对于对照进行定量(*P（P）与对照组或N-LDL相比<0.05）。
图2
图2
SOD或我-NAME可防止HOG-LDL诱导的PGIS失活和周细胞凋亡。答：人类视网膜周细胞暴露于HOG-LDL（100μg/mL）、N-LDL或载体24小时。用特异性抗体对PGIS进行免疫沉淀（IP），用Western blotting（WB）检测免疫沉淀中的PGIS和3-硝基酪氨酸（3-NT）。通过密度分析定量PGIS酪氨酸硝化(*P（P）与对照组或N-LDL相比<0.05，n个= 3).B类：通过分析6-keto-PGF评估PGIS活性α1，PGI的代谢物2，使用酶联免疫分析(*P（P）与对照组或N-LDL相比<0.05；n个= 5).抄送：通过Western blotting评估环氧合酶-2（COX-2）的表达(*P（P）与对照组或N-LDL相比<0.05；n个= 3).医生：用PEG-SOD（300 U/mL）预处理周细胞，我-名称（0.5 mmol/L），SQ29548（10−5或吲哚美辛（10μmol/L）30分钟，然后与HOG-LDL（100μg/mL）或N-LDL孵育24小时。TUNEL染色检测周细胞凋亡。条形图中显示了TUNEL阳性细胞的数量(*P（P）<0.05 vs.HOG-LDL；n个= 4).电子邮箱：通过分析PGI评估PGIS活性2代谢物PGFα1使用酶联免疫分析(*P（P）<0.05 vs.HOG-LDL；n个= 4).
图3
图3
天妇罗对WT和秋田小鼠体重和血糖的影响。答：平均体重(*P（P）与WT对照组相比<0.05【Con】；n个= 4).B类：使用Reli-On Ultima血糖监测系统测定尾血中的血糖(*P（P）与WT Con相比<0.05；n个= 4).
图4
图4
糖尿病增加秋田小鼠视网膜中氧化低密度脂蛋白、糖化低密度脂素和前列腺素IS硝化。A： 上部面板：氧化LDL和糖化LDL的免疫染色。用氧化低密度脂蛋白或糖化低密度脂素抗体对WT和秋田小鼠的视网膜切片进行染色，并用苏木精对细胞核进行复染。下部面板：氧化型低密度脂蛋白和糖化型低密度蛋白免疫组化染色定量分析[*P（P）与WT对照组（Con）相比<0.05；†P（P）<0.05 vs.秋田公司；n个= 4].B： 上部面板：在使用或不使用天妇罗治疗的WT和秋田小鼠的视网膜中对PGIS（绿色）和3-硝基酪氨酸（3-NT；红色）进行代表性免疫染色。合并图像中的黄色表示重叠的红色和绿色信号，表示3-硝基酪氨酸和PGIS染色的部分共定位。下部面板：3-NT免疫染色定量[*P（P）与WT对照组（Con）相比<0.05；†P（P）<0.05 vs.秋田公司；n个= 4].
图5
图5
iNOS和COX-2在秋田小鼠视网膜中的表达。答：iNOS免疫染色的代表性图像。用iNOS特异性抗体对WT、Akita和tempol处理的Akita小鼠的视网膜切片进行染色，并用苏木精对细胞核进行反染色。B类：通过Western blotting分析视网膜匀浆中iNOS的蛋白水平，并通过密度测定法进行定量[*P（P）与WT对照组（Con）相比<0.05；†P（P）<0.05 vs.秋田公司；n个= 4].抄送：视网膜切片用抗COX-2抗体染色，并用苏木精复染。日期：用Western blotting分析视网膜匀浆中COX-2的表达，并用密度测定法定量[*P（P）与WT对照组（Con）相比<0.05；†P（P）<0.05 vs.秋田公司；n个= 4].
图6
图6
糖尿病诱导秋田小鼠视网膜细胞凋亡。答：TUNEL染色的代表性图像。用TUNEL染色标记WT、Akita和tempol处理小鼠视网膜中的凋亡细胞，并用DAPI对细胞核进行反染。B类：条形图中显示了TUNEL阳性细胞的数量[*P（P）与WT对照组（Con）相比<0.05；†P（P）<0.05 vs.秋田公司；n个=每组4人]。抄送：劈理的西方分析(C类)视网膜匀浆中的caspase-3（c-Casp3）和PARP。医生：用密度测定法定量c-Casp3和c-PARP的蛋白质水平[*P（P）与WT对照组（Con）相比<0.05；†P（P）<0.05 vs.秋田公司；n个= 4].
图7
图7
Tempol保护秋田小鼠的视网膜紧密连接。A类和B类：通过Western blot分析测定WT和秋田小鼠视网膜中的白蛋白，并通过密度测定法进行定量[*P（P）与WT对照组（Con）相比<0.05；†P（P）<0.05 vs.秋田公司；n个= 4].C类和医生：通过Western blotting测定阻塞素-1水平并通过密度测定法定量(*P（P）与WT Con相比<0.05；†P（P）<0.05 vs.秋田公司；n个= 4).
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