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.2011年8月；3(8):782-93.
doi:10.18632/aging.100363。

化疗导致人类卵巢老化的机制：双链DNA断裂和微血管损伤

雷扎·索莱马尼 1, 埃尔克·海滕斯, 兹比格尼乌·达津基维奇, 库特鲁克·奥克泰
附属公司

化疗导致人类卵巢老化的机制：双链DNA断裂和微血管损伤

雷扎·索莱马尼等。 老龄化（纽约州奥尔巴尼市）. 2011年8月.

摘要

化疗导致卵巢衰老的机制尚不完全清楚。我们在多种体内异种移植和体外模型中使用了广泛使用的癌症化疗药物阿霉素，以研究化疗诱导的衰老对人类卵巢的影响。阿霉素以剂量依赖性的方式在原始卵泡、卵母细胞和颗粒细胞中引起大量双链DNA断裂，如γH2AX聚集灶所示。这种损伤与凋亡的卵母细胞死亡有关，并导致ATM的激活。修复反应似乎使一小部分卵母细胞（34.7%）和颗粒细胞（12.1%）存活下来，而大多数则死于凋亡死亡。矛盾的是，KU-55933对ATM的抑制可能通过阻止下游TAp63α的激活而导致生存率的提高。此外，阿霉素对人类卵巢造成血管和基质损伤，这可能会损害绝经前后的卵巢功能。化疗引起的卵巢早衰似乎是卵巢生殖细胞和非生殖细胞成分共同参与的复杂过程的结果。这些影响可能对绝经前和绝经后癌症幸存者的衰老具有临床意义。

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数字

图1
图1。阿霉素诱导人原始卵泡双链DNA断裂
术后人卵巢皮质片中γH2AX-阳性（黑箭头）和阴性（白箭头）原始卵泡在体外用剂量为1-100 mg/ml的阿霉素培养24或72小时。A-C）阿霉素在培养24小时后以剂量依赖性方式诱导DSB。注意，在用阿霉素100 mg/ml培养24小时后，原始卵泡中大量诱导DSB。D）72小时的溶媒对照。E-G）100 mg/ml的阿霉素治疗72小时也会导致卵巢组织坏死，同时基质细胞中大量表达γH2AX。H） 阴性对照，二级抗体缺失。一） DSB的诱导与培养24-72小时后阿霉素的剂量呈正相关（Spearman秩相关系数：0.967；p<0.001）。J） 用10mg/kg阿霉素治疗的SCID小鼠异种移植物中有大量γH2AX-阳性原始卵泡。K） 车辆处理（对照）人卵巢组织异种移植。#与对照组24小时显著不同*与对照组显著不同
图2
图2。阿霉素诱导原始卵泡凋亡死亡
人类卵巢皮质片中AC3阳性（黑色箭头）和阴性（白色箭头）原始卵泡和凋亡血管（红色箭头）。A-D）阿霉素在10和100μg/ml浓度培养24小时后诱导人原始卵泡凋亡。E） 72小时时的载体对照。F）阴性对照显示其中省略了初级抗体。G） 在培养的OCT中，阿霉素的剂量与凋亡原始卵泡的百分比之间存在显著相关性（斯皮尔曼秩相关系数：0.785；p=0.0001）。H） 经10mg/kg阿霉素处理后，SCID小鼠背肌异种移植的人卵巢组织中出现大量凋亡的原始卵泡。一） 氙气车辆处理控制。*24或72小时时与对照组显著不同。#24和72小时时，与1μg/ml阿霉素剂量显著不同。
图3
图3。阿霉素在SCID小鼠异种移植卵巢中诱导DSBs和凋亡卵泡死亡
异种移植SCID小鼠的卵巢在单次注射阿霉素10mg/kg后24小时恢复，并对γH2AX和AC3进行染色。A） 低倍镜下γH2AX-阳性原始卵泡卵母细胞（突出显示）。注意，γH2AX染色出现在颗粒细胞中，而不是相邻腔前卵泡的卵母细胞中。B） 用yH2AX染色高倍放大实心方形原始卵泡。C） B中相同的原始卵泡在相邻切片上显示AC3阳性染色，表明DSB诱导卵泡凋亡死亡。D） 阴性对照。一级抗体缺失，与B&C中的卵泡相同，在相邻的切片上，E）高倍放大图A中虚线方框中的γH2AX-阳性原始卵泡。F） 相邻切片同一卵泡D的AC3阳性染色。
图4
图4。阿霉素对卵巢皮质片血管密度的影响
用不同剂量阿霉素培养72小时的人卵巢皮质片中的A-C）CD31-阳性血管。阿霉素治疗导致血管密度降低，呈剂量依赖性。车辆处理控制。E） CD31-阳性血管在卵巢组织中显示为基线。F） 与所有三个受试剂量的对照组相比，阿霉素在所有剂量培养72小时后（但不是24小时培养）均导致卵巢血管密度显著降低。G） 阿霉素诱导的坏死和基质细胞死亡在体外（红色箭头）。H&I）类似于在体外实验表明，与用车辆处理的对照xengraft相比，阿霉素降低了异种移植物中的血管密度。黑色箭头显示人类卵巢皮质片中CD31阳性血管。*与对照组显著不同（72小时）。
图5
图5。阿霉素诱导小鼠卵母细胞双链DNA断裂、激活ATM并导致细胞凋亡
为了研究体内阿霉素对小鼠卵巢卵泡及其卵丘细胞的影响，动物单次注射阿霉素10mg/kg。24h后从卵巢取回GV卵母细胞和腔前小卵泡，并用共焦显微镜进行评估。A和B）阿霉素治疗导致多核化以及γH2AX表达增加。C&D）阿霉素诱导卵母细胞和周围颗粒细胞（箭头）凋亡，与DSB的诱导相关。E&F）阿霉素治疗后ATM在卵母细胞中的表达和定位。虽然较高量的ATM定位在对照卵母细胞的细胞质（cy）中（E），但阿霉素处理的卵母细胞在细胞核（nu）中显示出较高的定位（F）。G） 与它对卵母细胞的影响一致，阿霉素治疗后，ATM在小窦卵泡颗粒细胞中的表达也增加（黄色箭头）。H） 注意，阿霉素治疗在小窦卵泡颗粒细胞中诱导DSB（图像G中的分裂通道）。一） 少数颗粒细胞是非凋亡的，并且表达ATM，这表明DNA修复可能使他们能够克服基因毒性应激（黄色箭头）（图像G中的分裂通道）。J） 尽管激活了ATM（从图像G中分离出通道），但大多数仍经历了细胞凋亡。
图6
图6。小鼠GV卵母细胞彗星试验
在加入或不加入阿霉素（10μg/ml）培养24h后，用单细胞凝胶电泳（彗星试验）检测小鼠GV卵母细胞中的双链DNA断裂。显示了未处理（A）和阿霉素处理（B）卵母细胞的代表性图像。（C） 对照组与阿霉素处理的卵母细胞DNA损伤的定量研究；表示为尾部DNA的平均值（±SD）%。P=0.002（t检验）。
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