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.2011年10月；7(10):1212-21.
doi:10.4161/auto.7.10.16660。 Epub 2011年10月1日。

ULK1抑制mTORC1激酶活性和细胞增殖

张华荣（Chang Hwa Jung） 1, Minchul Seo先生, 尼尔·迈克尔·奥托, Do-Hyung Kim先生
附属公司

ULK1抑制mTORC1激酶活性和细胞增殖

张华荣（Chang Hwa Jung）等。 自噬. 2011年10月.

摘要

ULK1（Unc51-like kinase，hATG1）是一种Ser/Thr激酶，在饥饿诱导自噬反应中起关键作用。ULK1被雷帕霉素复合物1的哺乳动物靶点（mTORC1）磷酸化并负调控。先前的研究表明，ULK1不仅是mTORC1的下游效应器，而且是mTORC 1信号的负调节器。（1-3）在这里，我们研究了ULK1如何调节mTORC1信号，并发现ULK1抑制mTORCl的激酶活性和细胞增殖。ULK1或其同源物ULK2的缺失或敲低增强了mTORC1信号传导、细胞增殖率和细胞质量的积累，而ULK1的过表达具有相反的作用。敲除ULK1和ULK2的结合伙伴Atg13，模拟了ULK1或ULK2缺陷或敲除的影响。当ULK1或ULK2缺失或被敲低时，胰岛素和亮氨酸都在更大程度上刺激mTORC1信号传导。相反，Atg5缺乏对mTORC1信号传导和细胞增殖没有显著影响。ULK1敲除对mTORC1信号的刺激作用即使在没有结节性硬化复合物2（TSC2）的情况下也会发生，TSC2是mTORC2信号的负调控因子。此外，发现ULK1可以结合猛禽，诱导其磷酸化，并抑制mTORC1的激酶活性。这些结果表明，ULK1以独立于Atg5和TSC2的方式负调控mTORC1的激酶活性和细胞增殖。ULK1对mTORC1的抑制可能对通过优化细胞能量利用来协调调节细胞生长和自噬很重要。

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数字

图1
图1
ULK1、ULK2和Atg13，而不是Atg5，负调节mTORC1信号。（A） 敲除ULK1、ULK2和Atg13，但不敲除Atg5，增加了mTORC1信号。293T细胞通过Atg13、ULK1、ULK2或干扰shRNA（对照）转导。通过蛋白质凝胶印迹分析s6K1（p-Thr389）的磷酸化和蛋白质的表达水平。β-actin为负荷对照。（B） ULK1的过度表达抑制了S6K1的磷酸化。细胞裂解物是从293T过度表达myc标记ULK1的细胞或通过模拟载体转导的细胞中获得的。通过蛋白质凝胶印迹分析内源性S6K1（p-Thr389）的磷酸化状态。（C） ULK1缺乏增加了亮氨酸刺激的S6K1磷酸化。将ULK1 MEF在不含亮氨酸的RPMI培养基中培养40分钟，然后用亮氨酸（52µg/ml）补充细胞不同时间。通过蛋白凝胶印迹分析S6K1的磷酸化状态（p-Thr389）和表达水平。3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）是一种负荷控制。（D） ULK1缺乏增加胰岛素刺激的S6K1磷酸化。在不含血清的DMEM中培养ULK1 MEF过夜，并用胰岛素（10 nM）处理不同的培养时间。通过蛋白凝胶印迹分析S6K1（p-Thr389）和Akt（p-Ser473）的磷酸化状态及其表达水平。监测β-actin作为负荷对照。（E） ULK1敲除增加293T细胞中S6K1的磷酸化。如（D）所述，用胰岛素（100 nM）处理ULK1 shRNA或打乱shRNA（对照）转导的293T细胞。通过蛋白质凝胶印迹分析蛋白质的磷酸化状态和表达水平。（F） ULK2敲除增加了293T细胞中S6K1的磷酸化。用胰岛素处理ULK2 shRNA或打乱shRNA（对照）转导的细胞，并按所述（D）分析S6K1的磷酸化状态。（G） Atg5缺乏不会增加S6K1磷酸化。如（D）所述，用胰岛素治疗Atg5 MEF。
图2
图2
ULK1、ULK2和Atg13，而不是Atg5，负调节细胞增殖和细胞质量积累。（A） 敲除HeLa细胞中的ULK1、ULK2或Atg13可提高细胞增殖率。使用慢病毒载体，用ULK1、ULK2、Atg13或扰乱序列（对照）的shRNA稳定地转导HeLa细胞。在第1天、第2天和第3天计算细胞数（有关详细信息，请参阅材料和方法）。数值为对照细胞和每个shRNA转导细胞之间的平均值±标准差*p<0.01。（B） 敲除293T细胞中的ULK1可提高细胞增殖率。（c） MEF中ULK1缺乏可促进细胞增殖。（D） 293T细胞中ULK1过度表达降低了细胞增殖率。293T细胞由编码myc标记ULK1的质粒或空载体转导。（e） MEF中Atg5缺乏对细胞增殖没有显著影响。（F） 敲除HeLa细胞中的ULK1或Atg13可减小细胞大小。分析shRNA-转导的HeLa细胞的细胞大小（详见材料和方法）。打乱、ULK1-和Atg13-shRNA转导的细胞的平均直径分别为16.23±0.11、15.02±0.07和14.99±0.04µm。（G） 293T细胞中ULK1、ULK2和Atg13的敲除降低了细胞大小。打乱、ULK1、Atg13和ULK2 shRNA转导细胞的平均直径分别为14.72±0.08、14.35±0.11、14.25±0.09和14.10±0.13µm。（H） MEF中ULK1缺乏导致细胞尺寸减小。ULK1细胞的平均直径分别为17.42±0.14和17.17±0.09µm+/+和ULK1−/−分别为MEF。（一） MEF中Atg5缺乏使细胞大小略有增加。Atg5的细胞平均直径分别为17.55±0.12和17.86±0.10µm+/+和附件5−/−分别为MEF。（J） 敲除HeLa细胞中的ULK1、ULK2或Atg13增加了总细胞质量。总细胞质量是使用第3天的细胞数量和细胞体积计算的。将总细胞质量的平均值±标准差转换为相对于对照组细胞质量的百分比值*对照细胞和每个shRNA-转导细胞之间p<0.05。（K） 293T细胞中ULK1的敲除增加了总细胞质量。数据分析如（J）所述。（五十） MEF中ULK1的缺失增加了总细胞质量。（M）MEF中Atg5的缺失略微增加了细胞总质量。
图3
图3
ULK1独立于TSC2抑制mTORC1信号。TSC2系统+/+和TSC2−/−使用慢病毒载体，通过ULK1或超临界shRNA稳定地转导MEF。shRNA转导的细胞在无血清条件下培养过夜，并用胰岛素（10 nM）处理30分钟。通过蛋白凝胶印迹分析磷酸化状态和S6K1和Akt的表达水平。
图4
图4
ULK1和ULK2绑定到猛禽。（A） ULK1、ULK2和Atg13与猛禽结合。用HA标记的猛禽在293T细胞中表达Myc-tagged结构。转染后48小时，通过蛋白质凝胶印迹分析通过使用抗myc抗体的免疫沉淀分离的HA猛禽的量。使用HA标记的S6K1作为阴性对照。（B） HA-标记的ULK1与293T细胞中myc标记的猛禽共同免疫沉淀。采用Myc-tagged tubulin和S6K1作为阴性对照。（C） 在内源性水平确认ULK1-受体相互作用。分别使用抗猛禽和抗猛禽抗体从293T细胞中获得猛禽和猛禽免疫沉淀物。用蛋白凝胶印迹法测定免疫复合物中ULK1的含量。星号（*）表示150 kDa附近的非特定带。（D） 293T细胞内源性水平raptor-ULK1相互作用的确认。免疫前血清用作阴性对照。（E） 猛禽和ULK1之间的相互作用不需要Atg13。对shRNA转导的293T细胞进行猛禽免疫沉淀。用蛋白凝胶印迹法分析猛禽免疫沉淀物中ULK1、Atg13和猛禽的数量。（F） 猛禽需要全长才能绑定到ULK1。来自猛禽的全长（aas 1–1335）或片段在293T细胞和myc标记的ULK1中表达为HA标记版本。用蛋白凝胶印迹法分析HA免疫沉淀物中myc-ULK1的含量。
图5
图5
ULK1调节mTOR-受体相互作用以响应胰岛素并诱导猛禽磷酸化。（A） ULK1缺乏会破坏体外对胰岛素的mTOR-受体相互作用，这种破坏与S6K1磷酸化水平较高有关。使用胰岛素治疗ULK1 MEF，如图1D在含有0.3%CHAPS的细胞裂解缓冲液中，用抗mTOR抗体获得.mTOR免疫沉淀，并用蛋白凝胶印迹法分析猛禽数量。（B） 293T细胞中的ULK2敲除破坏了胰岛素反应中mTOR受体的相互作用。用胰岛素处理shRNA-转导的293T细胞，如图1D用免疫共沉淀法和蛋白质凝胶印迹法分析mTOR免疫沉淀中猛禽的数量。（C） ULK1基因敲除抑制了猛禽在SDS-PAGE上的迁移。用SDS-PAGE对shRNA-转导的293T细胞中的猛禽进行分析，这些细胞用胰岛素处理30分钟。（D） ULK1缺乏抑制了猛禽的机动性转移。对使用胰岛素治疗30分钟的ULK1 MEF中的猛禽进行分析。（E） ULK1诱导猛禽的磷酸化。用myc标记的ULK1野生型（wt）或M92A激酶死亡突变体（kd）在293T细胞中表达HA标记的猛禽。用抗myc抗体免疫沉淀法分离HA-raptor和myc-ULK1。将myc免疫沉淀物用或不用lambda磷酸酶处理后，用蛋白凝胶印迹法分析猛禽和ULK1在SDS-PAGE上的迁移模式。
图6
图6
ULK1抑制mTORC1的激酶活性。（A） ULK1对mTORC1的激酶活性有负面影响。mTOR是从ULK1 MEFs中分离出来的。以S6K1为底物分析mTOR的激酶活性。通过蛋白质凝胶印迹分析S6K1在Thr389的磷酸化状态。磷酸化水平在右侧的条形图中进行了定量分析。数值为三个独立实验的平均值±标准偏差*p<0.05。（B） 以4E-BP1为底物，在体外评估ULK1对mTORC1激酶活性的抑制作用。条形图表示对Thr37/46处4E-BP1磷酸化状态的定量评估。数值为两个独立实验的平均值±标准偏差*p<0.05。由于我们在SDS-PAGE中使用了大量丙烯酰胺来分析4E-BP1，所以猛禽的迁移率变化尚不清楚。（C） 分析从ULK1 MEFs分离的猛禽免疫沉淀物对4E-BP1磷酸化的激酶活性。（D） 分析从打乱（sc）或ULK1 shRNA-转导的293T细胞中分离的猛禽免疫沉淀物对4E-BP1磷酸化的激酶活性。（E） 分析从ULK1 MEFs中分离的Rictor免疫沉淀物对Ser473处Akt磷酸化的激酶活性。（F） ULK1复合体和mTORC1之间相互调节的模型。
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