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.2011;19(3):163-74.
doi:10.1159/000328516。 Epub 2011年7月22日。

帕金森病细胞模型中白藜芦醇激活的AMPK/SIRT1/自噬

吴运城 1, 李新群, 朱莉·小红（Julie Xiaohong Zhu）, 谢文杰, 伟东乐, 甄凡, 约瑟夫·扬科维奇, 天虹盘
附属公司

帕金森病细胞模型中白藜芦醇激活的AMPK/SIRT1/自噬

吴运城等。 神经信号. 2011.

摘要

过度错误折叠的蛋白质和/或功能失调的线粒体可能导致能量缺乏，这与帕金森病（PD）的发病机制有关。据报道，通过自噬增强错误折叠蛋白或受损线粒体的清除在PD模型中具有神经保护作用。事实上，白藜芦醇是一种已知的化合物，具有与能量代谢相关的多种有益作用，这一事实促使我们探索白藜芦醇的神经保护作用是否与其在自噬调节中的作用有关。我们测试了哺乳动物沉默信息调节器2（SIRT1）和/或代谢能量传感器AMP-activated protein kinase（AMPK）的调节是否参与白藜芦醇的自噬诱导，从而导致神经元存活。我们的结果表明，白藜芦醇通过自噬诱导，保护SH-SY5Y细胞免受鱼藤酮诱导的凋亡，并增强表达α-突触核蛋白的PC12细胞系中α-突触素的降解。我们发现，抑制AMPK和/或SIRT1导致LC3-II蛋白水平下降，表明AMPK或SIRTI在白藜芦醇介导的自噬诱导中是必需的。此外，AMPK的抑制导致SIRT1活性的抑制，并减弱了白藜芦醇对鱼藤酮诱导的凋亡的保护作用，进一步表明AMPK-SIRT1-自噬途径在白藜芦醇对PD细胞模型的神经保护中起重要作用。

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数字

图1
图1
白藜芦醇对自噬的药理学诱导。一用白藜芦醇在0、12.5、25和50μM浓度下处理SH-SY5Y细胞48小时，或在50μM温度下处理0、24、48和72小时。用抗LC3抗体免疫印迹法测定LC3蛋白水平。b条用白藜芦醇处理SH-SY5Y细胞48 h，然后用吖啶橙（1μg/ml）染色。通过FACScan流式细胞仪分析确定自噬的诱导。显示了FACScan分析曲线，网格顶部被视为AVO。AVO的发展被量化并表示为总细胞的百分比。数据为平均值8 SD。平均值来自三个独立实验。**与对照组相比，p<0.01。c（c）细胞转染后48小时Beclin 1 siRNA或其干扰对照（#3 siRNA），在50μM浓度下用或不用白藜芦醇处理细胞48小时。细胞裂解物进行免疫印迹分析，Beclin 1和LC3的蛋白水平分别用抗Beclin l和抗LC3抗体测定。d日收获前3小时，用50μM白藜芦醇处理细胞24小时，用Baf-1（200 nM）处理细胞。或者，用NH预处理细胞4Cl（10 mM）过夜，然后白藜芦醇处理24 h。对细胞裂解物进行免疫印迹分析，并用抗p62和抗LC3抗体测定p62和LC3的蛋白水平。e（电子）白藜芦醇处理SH-SY5Y细胞48h后固定。在JEM 1010透射电镜下用电子显微镜分析了自噬液泡的双膜结构。红色方框表示自噬空泡，包括自噬体。高倍镜下显示含有细胞内内容物的自噬体（×50000）。N=核。
图2
图2
白藜芦醇减轻鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞损伤。将SH-SY5Y细胞暴露于鱼藤酮（10μM）中24 h，并进行或不进行白藜芦醇（50μM）预处理24 h。通过活/死实验观察细胞形态和细胞存活与死亡的变化。SH-SY5Y细胞用1μM钙黄绿素AM和1.5μM乙炔同二聚体-1染色20分钟，然后用荧光显微镜测量活细胞或死细胞。钙黄绿素AM产生的绿色荧光表示活细胞，乙炔二聚体-1产生的红色荧光表示死细胞。对三个随机显微镜切片的死细胞进行计数。对死亡细胞的数量进行计数，并将数值表示为总细胞的百分比。数据表示为平均值±标准偏差。*与Con相比，p<0.01；**与Rot相比，p<0.01。b条用ELISA法定量细胞质中组蛋白相关DNA片段的水平。从三个独立实验中收集数据，并表示为平均值±SD。*与Con相比，p<0.01；**与Rot相比p<0.05。c（c）对全细胞裂解物进行免疫印迹分析，以测定裂解的PARP和caspase-3的蛋白水平。β-肌动蛋白被用作蛋白质的等量负载。Con=控制；RV=白藜芦醇；Rot=鱼藤酮。
图3
图3
白藜芦醇通过自噬诱导介导的神经保护作用。一用白藜芦醇在不含或含有3MA（10 mM）的情况下预处理SH-SY5Y细胞24小时，然后再暴露于鱼藤酮24小时。通过抗PARP和抗LC3抗体的免疫印迹分析评估细胞凋亡和自噬诱导。b条SH-SY5Y细胞转染贝克林1siRNA（100 nM）或阴性对照#3 siRNA 48小时，然后暴露于鱼藤酮中，无论是否进行白藜芦醇预处理。对全细胞裂解物进行免疫印迹分析，并用抗PARP抗体评估细胞凋亡。c（c）分离细胞液部分并进行免疫印迹分析。细胞色素水平c（c）用抗细胞色素c抗体测定细胞液中的含量。用抗COX IV抗体测定胞浆部分的纯化。
图4
图4
白藜芦醇清除α-突触核蛋白。一用强力霉素（1μg/ml）在稳定的可诱导PC12细胞系中诱导野生型A30P或A53Tα-同核蛋白转基因48 h，然后用白藜芦醇处理24 h，无论是否使用溶酶体抑制剂NH 4 Cl（10 mM）。b条表达野生型、A30P或A53Tα-突触核蛋白的稳定可诱导PC12细胞系转染贝克林1siRNA（100 nM）或阴性对照#3 siRNA。转染24 h后，用多西环素（1μg/ml）诱导细胞36 h。用新鲜培养基替换，然后用白藜芦醇处理24 h，从而关闭转基因表达。用抗α-突触核蛋白抗体的免疫印迹法评估α-突触素的清除。
图5
图5
白藜芦醇通过AMPK/SIRT1激活诱导自噬。a、 b条用不同浓度的白藜芦醇处理SHSY5Y细胞24小时(一)或在50μM下持续不同时间(b条).c（c）用AMPK抑制剂化合物C在10μM下预处理SHSY5Y细胞3小时，然后添加白藜芦醇24小时，再在细胞转染SIRT1 siRNA或其干扰对照#3 siRNA后48小时，在50μM下处理细胞或不处理细胞48小时。对全细胞裂解物进行免疫印迹分析，并用指示的特异性抗体测定蛋白质水平。
图6
图6
AMPK在白藜芦醇神经保护中的激活。一SH-SY5Y细胞暴露于鱼藤酮（10μM）不同时间。b条在没有或存在化合物C（10μM）的情况下，用鱼藤酮（10μM）处理SH-SY5Y细胞。c（c）用白藜芦醇（50μM）在有或无化合物C（10μM）的情况下预处理SH-SY5Y细胞24 h，然后暴露于鱼藤酮16 h。用抗PARP抗体的免疫印迹法评估细胞凋亡。通过测量p-AMPK和p-ACC的蛋白水平来确定AMPK的激活。CC=化合物C。
图7
图7
AMPK/SIRT1/白藜芦醇介导的自噬性神经保护。白藜芦醇会激活AMPK/SIRT1，然后诱导自噬。诱导的自噬增强了受损线粒体的清除，这一过程被称为“线粒体吞噬”，通过此过程，受损线粒体释放的细胞色素c的蛋白质水平降低，导致鱼藤酮诱导的凋亡减少。同时，诱导的自噬可以增强α-突触核蛋白的清除。白藜芦醇对受损线粒体的作用和增加的α-突触核蛋白可能有助于白藜芦醇对PD的神经保护作用。
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