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.2011年8月19日；286(33):28931-28939.
doi:10.1074/jbc。M111.250324。 Epub 2011年6月28日。

Atg13蛋白介导的Atg1蛋白激酶的自结合对诱导自噬很重要

余英叶 1, Khyati H Shah公司 2, 保罗·K·赫尔曼 三
附属公司

Atg13蛋白介导的Atg1蛋白激酶的自结合对诱导自噬很重要

余英叶等。 生物化学杂志. .

摘要

真核细胞中的自噬途径介导多种细胞质成分的周转，包括受损的细胞器和异常的蛋白质聚集体。自噬介导的降解受到高度调节，这些途径中的缺陷与许多人类疾病有关。Atg1蛋白激酶似乎是这种控制的关键部位，并通过多种信号通路进行靶向，以确保对不断变化的环境条件作出适当的自噬反应。尽管这种激酶很重要，但对Atg1激活的分子细节知之甚少。在本研究中，我们表明，Atg13是Atg1的一种进化上保守的调节因子，它促进了出芽酵母酿酒酵母中特定Atg1自交互作用的形成。这种Atg1-Atg1复合物的出现与自噬的诱导有关，破坏这种复合物的条件会导致自噬和Atg1激酶活性降低。此外，在Atg1中添加异源二聚化结构域可在体内外提高激酶活性。该复合物的形成似乎是Atg1激活环中Thr-226随后自动磷酸化的重要先决条件。先前的工作表明，这种修饰对Atg1激酶的活性来说是必要的，也许是足够的。有趣的是，这种Atg1自结合并不需要Atg17，这表明第二个保守的调节器可能以与Atg13不同的机械方式激活Atg1。总之，这项工作提出了一个模型，即这种自结合刺激Atg1在其激活环内的自动磷酸化。

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图1。
图1。
Atg1参与自我互动体内. A类，示意图显示了这些结合研究中使用的不同Atg1结构。附件1-FL指全长Atg1蛋白着色区域表示N末端蛋白激酶结构域。B类，全长Atg1表现出强大的自我相互作用。从表达所指示的myc表位标记的Atg1片段以及HA标记的全长Atg1的细胞制备提取物。HA三-在α-HA亲和树脂上沉淀Atg1，并用α-myc抗体进行Western blotting评估相关Atg1片段的相对数量。由闭合的圆是样品中存在的降解产物。Vec公司，向量。C类，Atg1蛋白激酶结构域与全长Atg1的相互作用较弱。如上所述，采用联合免疫沉淀法评估两个全长Atg1蛋白或1-330片段与全长Atgl之间的相互作用。在每个病例中沉淀出全长HA标记的Atg1，并用α-myc抗体通过Western blotting评估相关全长Atg1或1-330片段的相对量。为了评估相互作用的相对强度，将含有两个全长Atg1蛋白的提取物中1/20×和1/50×量的免疫沉淀混合物加载到凝胶上。佛罗里达州指全长Atg1。显示了全长Atg1和Atg1的1–330片段的位置。D类，在Atg1的两个1-330片段之间观察到相互作用。将HA标记的片段沉淀在α-HA亲和树脂上，并用α-myc抗体通过Western blotting评估相关myc标记片段的数量。
图2。
图2。
自噬细胞中Atg1-Atg1复合物水平升高。日志阶段(L（左）)或雷帕霉素处理(R（右）)如“实验程序”所述，将细胞与交联剂二硫代双[琥珀酰亚胺丙酸]孵育30分钟。细胞表达全长Atg1-myc三带或不带全长HA三-附件1，如图所示。制备细胞提取物，HA三-Atg1沉淀在α-HA亲和树脂上。相关Atg1-myc的相对量三然后按照“实验程序”中的描述，通过Western blotting进行评估
图3。
图3。
Atg1自我结合需要Atg13蛋白的存在。 A类，Atg1-Atg1复合物的水平在第13天Δ细胞提取物。在表达全长Atg1-myc的指示菌株中，评估了Atg1自身相互作用的相对水平三带或不带全长HA三-附件1.HA三-Atg1在α-HA亲和树脂上沉淀，相关的Atg1 myc的相对量三用α-myc抗体通过蛋白质印迹进行评估。B类，Atg1自结合的相对水平在过度表达的细胞中升高(运行经验)附件13。显示的值顶部面板下方表明共同免疫沉淀反应中存在的Atg1-myc蛋白的相对水平。用ImageJ程序量化Western blot信号，并将其归一化为载体中的信号(Vec公司)控制车道。C类，激酶缺陷型Atg1K54A公司变异体表现出正常的自我交互作用。在表达myc和HA标记的野生型Atg1或激酶缺陷型变体Atg1的细胞中检测Atg1自结合K54A公司，如图所示。
图4。
图4。
Atg17的过度表达导致自噬和Atg1激酶活性降低。 A类，在过度表达Atg17的细胞中，自噬水平降低。根据“实验程序”中的描述，采用基于Pho8Δ60的碱性磷酸酶检测评估自噬。图中显示了指示菌株中存在的相对自噬活性；wild类型被赋值为100%。B类，在过度表达的细胞中，Thr-226的Atg1自动磷酸化水平降低(运行经验)附件17。在过表达Atg13或Atg17的细胞中，通过用α-Thr（P）-226磷酸特异性抗体进行蛋白质印迹来评估Atg1中Thr-226磷酸化的相对水平（27）。如“实验程序”所述，使用LICOR Biosciences Odyssey红外成像系统测定Thr-226磷酸化水平和总Atg1蛋白底部面板显示了α-Thre（P）-226和α-HA面板的合并图像，前者为假彩色绿色，后者是红色注意，不同的暴露时间用于说明Atg13和Atg17过度表达的相关影响。附件1-P表示Atg1的自磷酸化形式在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上异常迁移的位置（24，28）。
图5。
图5。
Atg1的C末端结构域对于与Atg13的相互作用是必要的和充分的。 A类，示意图描述了用于此处描述的映射分析的Atg1片段。B类和C类，Atg13与Atg1的C末端片段特异性相互作用。从酵母细胞中免疫沉淀HA-Atg13，酵母细胞也表达指示的Atg1 myc标记片段。免疫沉淀物中Atg1片段的相对水平通过α-myc抗体的Western blotting进行评估。这个闭合的圆指示样品中存在的降解产物。佛罗里达州，全长。Vec公司，矢量。
图6。
图6。
Atg1的331-C片段的过度表达特别破坏了Atg13和Atg1之间的相互作用。 A类，Atg1的331-C片段的过度表达破坏了Atg13和Atg1之间的相互作用。Atg1的331-C片段在含有HA标记的Atg13和myc标记的Atg 1的细胞中过度表达。在α-HA亲和树脂上收集Atg13，并用α-myc抗体通过Western blotting评估相关Atg1的数量。B类，Atg1的331-C片段的过度表达并不影响Atg13和Atg17之间的相互作用。Atg1的331-C片段在含有myc标记Atg17和HA标记Atg1或Atg13的细胞中过度表达。在α-HA亲和树脂上收集后一种HA标记的蛋白质，并用α-myc抗体通过Western blotting评估相关Atg17的数量。C类，Atg17与Atg1的C末端331-C结构域发生相互作用。显示的Atg1片段（全长，1-330和331-C）的HA标记版本与myc标记的Atg17在细胞中共同表达。在α-HA亲和树脂上收集HA标记的片段，并用α-myc抗体通过Western blotting评估相关Atg17的数量。注意，对应于Atg1不同HA标记片段的Western blot条带拼接在一起，以便于比较蛋白质水平。
图7。
图7。
含TID的Atg1片段的过度表达导致了Atg1自我作用的中断。 A类，Atg1的331-C片段过度表达导致Atg1-Atg1复合物水平降低。Atg1的1–330和331-C片段在同样表达HA和myc标记的全长Atg1版本的细胞中过度表达。通过Western blotting检测在α-HA亲和树脂上收集的免疫沉淀物中是否存在Atg1-myc蛋白，以检测Atg1自身相互作用。B类，Atg1的331-C片段的量的增加导致Atg1自身相互作用的相应更大的破坏。C类，600-C片段是能够中断Atg1自我交互作用的最小Atg1域。如上文所述，对过度表达所示的Atg1片段对Atg1自我交互作用的影响进行了评估A类.
图8。
图8。
含TID的Atg1片段的过度表达导致自噬和Atg1蛋白激酶活性降低。 A类，含有TID的Atg1片段的过度表达导致自噬活性受到抑制。采用基于Pho8Δ60的碱性磷酸酶分析法评估野生型菌株TN125的自噬活性，该野生型菌株过度表达Atg1的指示片段。该图显示了归一化为野生型后所示菌株中存在的相对自噬活性。B类在过度表达含TID的Atg1片段的细胞中，Thr-226处Atg1自身磷酸化水平降低。用α-Thr（P）-226磷酸特异性抗体通过Western blotting评估Thr-226磷酸化的相对水平（27）。如“实验程序”所述，使用LICOR Biosciences Odyssey红外成像系统测定Thr-226磷酸化水平和总Atg1蛋白附件1-P表示Atg1的自磷酸化形式在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上异常迁移的位置（24，28）。C类，与Atg1 550-C片段过度表达相关的自噬抑制被过量的Atg13抑制。用基于Pho8Δ60的碱性磷酸酶测定法评估指示细胞的自噬活性。该图显示了归一化为野生型后所示菌株中存在的相对自噬活性。重量是指野生型酵母菌株TN125。
图9。
图9。
异源二聚体结构域的添加导致Atg1蛋白激酶活性升高第13天Δ应变。 A类，亮氨酸拉链二聚化基序的存在导致Atg1自动磷酸化增加在体外.Atg1和Atg1-ZIP从任一对数期免疫沉淀(灰色条)或雷帕霉素处理过的(黑色条)单元格，以及在体外用[γ-32P] ATP如“实验程序”所述。然后将反应产物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上用完，并通过磷光成像评估加入Atg1的放射性标记量。这个下部面板指示激酶反应中存在的相对Atg1蛋白量。L（左），对数相位；R（右），雷帕霉素处理。B类，二聚化结构域的存在导致Thr-226的Atg1自动磷酸化水平升高体内用α-Thr（P）-226磷酸特异性抗体进行Western blotting，评估所示蛋白质在Thr-226的相对磷酸化水平。在分析之前，用200 ng/ml雷帕霉素处理细胞1小时。使用LICOR Biosciences Odyssey红外成像系统测定Thr-226磷酸化水平和总Atg1蛋白。Thr（P）-226指数是指Atg1蛋白含量正常化后的α-Thr（P）-236信号。C类，显示了一个用于激活Atg1的模型。Atg13与Atg1的C末端结构域和Atg17结合。与Atg13的这种相互作用促进了Atg1的自结合，从而导致激活环中Thr-226的后续自动磷酸化；分子间的，或在反式，反应如图所示。注意，该复合物中不同蛋白质的相对化学计量比尚未确定。有关更多详细信息，请参阅“讨论”。
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    1. Todde V.、Veenhuis M.、van der Klei I.J.（2009）《生物化学》。生物物理学。1792年3月13日学报-公共医学
    1. 水岛N.（2007）《基因发展》21，2861–2873-公共医学
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