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.2011年7月8日；333(6039):228-33.
doi:10.1126/science.1205405。 Epub 2011年5月26日。

自噬受体视神经蛋白磷酸化抑制沙门氏菌生长

菲利普·怀尔德 1, 赫索·法尔汗, 大卫·G·麦克尤恩, 塞巴斯蒂安·瓦格纳, 弗拉基米尔·罗戈夫, 内森·R·布雷迪, 本杰明·里希特, 杰勒娜·科拉克, 奥利弗·韦德曼, Chunaram Choudhary公司, 沃尔克·多奇, 德克·布曼, 伊万·迪基奇
附属公司

自噬受体视神经蛋白磷酸化抑制沙门氏菌生长

菲利普·威尔德等。 科学类. .

摘要

选择性自噬可以通过受体分子介导，受体分子将特定货物连接到由泛素样微管相关蛋白轻链3（LC3）修饰物修饰的自噬体膜。尽管已经鉴定出几种自噬受体，但对其在体内控制功能的机制知之甚少。在这项工作中，我们发现自噬受体视神经蛋白的磷酸化促进了泛素包裹的细胞溶质肠炎沙门氏菌的选择性自噬。蛋白激酶TANK结合激酶1（TBK1）磷酸化丝氨酸-177上的视神经蛋白，增强细胞溶质沙门氏菌的LC3结合亲和力和自噬清除。相反，泛素或LC3-结合视神经素突变体和视神经素或TBK1的沉默会损害沙门氏菌的自噬，导致细胞内细菌增殖增加。我们认为自噬受体的磷酸化可能是调控货物选择性自噬的一般机制。

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数字

图1
图1
OPTN是一种自噬受体。(一个)OPTN域架构的示意图。下面显示了已知LIR基序的排列，四肽LIR以粗体突出显示。显示了LIR的N-末端、酸性残基（绿色）和潜在的磷酸化位点（红色），它们被认为是延长的LIR的一部分。CC，线圈；氨基酸；ZnF，锌指。(B类)诱饵蛋白（pYTH9:scAtg8、GABARAPL-1、LC3A和SUMO1）和猎物OPTN变体的定向酵母双杂交[pACT2：全长OPTN WT、LIR突变体（F178A）或泛素结合突变体（E478G）]。p62 LIR（aa 311-444）也包括在内。使用β-半乳糖苷酶分析评估相互作用。(C类)使用GST或GST-泛素样蛋白对来自稳定MCF-7细胞的EGFP-OPTN进行GST下拉分析。IB，免疫印迹。(D类)HeLa细胞过度表达EGFP-OPTN并经营养剥夺加上定位于内源性LC3B和泛素（插图）的溶酶体巴非霉素A1（ND/BafA1）处理的典型共聚焦图像。比例尺，10μm。(E类)通过ImageStream分析，对单个细胞内表达mCherry-LC3B和EGFP-OPTN的≥1000个细胞进行定殖量化[WT和缺失；ΔLIR（Δ178-181）或点突变F178A]。误差线表示平均值±SD；n个=3个独立实验*P（P）< 0.05; 单尾，成对吨测试。
图2
图2
TBK1磷酸化延伸LIR基序内的OPTN。(一个)在有或无1μM BX795的情况下，用1μg/ml LPS刺激MEF达到指定的时间点。用抗OPTN、磷酸化OPTN（Ser177)、总IRF3和磷酸化IRF3（pSer396). pSer系列177BX795抑制TBK1后，OPTN丢失。(B类)MEF未经处理或用LPS刺激30分钟，裂解，内源性OPTN用GST-LCB沉淀。(C类)SILAC标记的未经处理或30分钟LPS刺激的MEF细胞和用GST-GABARAPL1沉淀的OPTN，并通过质谱（MS）进行分析。MS光谱显示荧光粉Ser富集177与对照组相比，LPS刺激的细胞中的OPTN。(D类)使用OPTN肽（名称为LIR_P0（无磷酸化）、LIR_P1（pSer））对LC3B进行ITC滴定177)（中间）和LIR_Ptot（所有丝氨酸磷酸化，左）-对应于人类OPTN氨基酸169至184（右）。显示了原始数据（上框）、每个滴定步骤的综合热量（点）和最佳拟合曲线（下框）。计算假定一个单站点绑定模型。离解常数(K（K）d日)在磷酸化的OPTN丝氨酸残基存在下，LC3B对OPTN LIR的亲和力增强，降低了5-13倍。Ka，酸常数；ΔH，焓变化；ΔS，熵的变化。
图3
图3
磷酸化OPTN与泛素和LC3B阳性细胞溶质共定位沙门氏菌. (一个)表达EGFP-OPTN和mCherry-LC3B的HeLa细胞在感染鼠伤寒沙门氏菌（SL1344）4小时后的共聚焦图像。EGFP-OPTN与LC3B（上面板）在沙门氏菌.磷酸-丝氨酸177OPTN本地化为EGFP-expressing沙门氏菌（MW57），Ub为1 hpi。比例尺，10μm。(B类)EGFP-OPTN（绿色）和pS177 OPTN沙门氏菌sifA（蓝色）。(C类)细胞溶质共定位的量化沙门氏菌sifA–含EGFP-OPTN、泛素和pSer177与1μM BX795处理的细胞相比，来自（B）中所示细胞的OPTN。误差线表示平均值±SEM。
图4
图4
沙门氏菌体内缺乏OPTN时，增殖增强。(一个)转染有指示siRNAs的HeLa细胞感染了沙门氏菌（SL1344），并在感染后指定的时间点进行裂解，在选择性琼脂平板上计数细菌菌落。(B类)转染指定siRNAs并感染的HeLa细胞中回收的细菌数量沙门氏菌对于8 hpi。细胞内沙门氏菌复制计算为2小时时的倍数增加。OPTN、NDP52或TBK1的耗竭导致沙门氏菌细胞内复制。误差线表示的平均值±SDn个=3个独立实验*P（P）<0.002，双尾吨测试。CFU，菌落形成单位。(C类)用ShRNA-OPTN-WT、shR-OPTN F178A和shR-OPPN E478G瞬时重组缺失ShRNA-OPPN的HeLa细胞。与OPTN WT相比，OPTN的LIR突变体和Ub-binding突变体均未能拯救缺乏OPTN HeLa细胞8 hpi。误差条显示平均±SDn个=3个独立实验。(D类)共焦图像z堆栈的三维重建沙门氏菌-感染HeLa细胞4 hpi。EGFP-OPTN WT（绿色）、NDP52（红色，左侧面板）和内源性p62（红色，右侧面板）在细胞溶质表面形成明显的“斑块”沙门氏菌.
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