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.2011年6月17日；332(6036):1429-33.
doi:10.1126/science.1204592。 Epub 2011年5月26日。

TFEB将自噬与溶酶体生物发生联系起来

卡明·塞滕布雷 1, 基亚拉·迪马耳他, 维尼西亚政治协会, 莫伊斯·加西亚·阿伦西比亚, 弗朗西斯科·维特里尼, 塞尔坎·埃尔丁, Serpil Uckac埃尔丁, Tuong Huynh公司, 迭戈·麦迪纳, 帕斯夸利娜·科尔拉, 马尔科·萨迪埃洛, 大卫·C·鲁宾斯坦, 安德烈亚·巴拉比奥
附属公司

TFEB将自噬与溶酶体生物发生联系起来

卡明·塞滕布雷等。 科学类. .

摘要

自噬是一个依赖于自噬体和溶酶体协同作用的细胞分解代谢过程。在饥饿期间，细胞会扩大两个隔间，以加强降解过程。我们发现饥饿激活了一个转录程序，该程序控制着自噬途径的主要步骤，包括自噬体形成、自噬小体-溶酶体融合和底物降解。转录因子EB（TFEB）是溶酶体生物发生的主基因，通过驱动自噬和溶酶体基因的表达来协调这一程序。TFEB的核定位和活性受细胞外信号调节激酶2介导的丝氨酸磷酸化调节，其活性由细胞外营养物质水平调节。因此，有丝分裂原激活的蛋白激酶依赖机制通过控制两个不同细胞器的生物发生和伙伴关系来调节自噬。

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数字

图1
图1
TFEB诱导自噬。(一)用GFP-LC3质粒转染的对照和稳定过度表达的TFEB-HeLa细胞的倒置彩色显微照片，处理如下：正常培养基（正常）、2小时的400 nM巴非霉素（巴非霉素）和2小时的无营养培养基（饥饿）~每个处理分析100个细胞。图中显示了每个细胞GFP阳性小泡的平均数。(B类)以LC3-II强度（相对于肌动蛋白）的量化表示的指定时间（h，h）饥饿的稳定TFEB过度表达细胞（Starv）中LC3的免疫印迹分析。(C类)从TFEB-RNAi（+）和在正常培养基、饥饿培养基或补充有bafilomycin（baf，400 nM，4小时）的饥饿培养基中培养的扰乱RNAi处理细胞（-）中分离的细胞裂解物，作为LC3-II强度的量化（相对于肌动蛋白）。(D类)靶向TFEB或打乱序列（ctr）的siRNA寡聚体转染细胞的TFEBmRNA水平。(E类)用空（对照）或TFEB载体转染稳定表达GFP-mRFP-LC3的固定HeLa细胞的代表性共焦图像显示为每个细胞相对于对照的小泡平均数（%）。对2000个细胞的Aminimum进行计数。AL（自溶体）=（mRFP-阳性囊泡）/（GFP-阴性囊泡）；mRFP阳性小泡总数。所有值都是至少三个独立实验的平均TSEM。学生的t吨测试（未配对）；*P（P）< 0.05,**P（P）< 0.01.
图2
图2
饥饿调节TFEB核移位和活动。(一)比较在不同条件下培养的对照和TFEB过表达HeLa细胞中51个自噬相关基因的表达水平。结果用散点图表示，其中圆圈表示具有增加（红色）或减少（绿色）倍变化（对数值）的基因；x个轴，对照组；年axis，治疗组。(B类)HeLa细胞在正常或饥饿培养基中培养4小时后稳定过度表达TFEB的典型图像。对来自五个独立实验的五个区域（每个区域包含50到100个细胞）进行TFEB核定位分析：细胞核，4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）；TFEB，标志。数值为平均值±SEM；学生的t吨测试（未配对）**P（P）<0.01. (C类)对细胞进行核和/或细胞溶质分离，并用Flag抗体进行印迹。H3和微管蛋白分别用作细胞核和胞质标志物。(D类)饥饿细胞按指示处理（EGF，表皮生长因子；FGF，成纤维细胞生长因子；PMA，佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐）。用针对Flag和H3（负荷控制）的抗体对核组分进行印迹。(E类)对正常、饥饿和饥饿的细胞核提取物中的Flag、tubulin和H3进行免疫印迹分析，然后在正常培养基中刺激细胞1小时（正常），或在培养基刺激前1小时用AKT抑制剂、雷帕霉素mTOR抑制剂和MAPK抑制剂预处理。总提取物用于验证抑制剂（p-ERK，磷酸化ERK激酶；Rap，雷帕霉素）的效率。
图3
图3
丝氨酸磷酸化调节TFEB激活。(一)表达TFEB-3xFlag突变版本的HeLa细胞中TFEB亚细胞定位的标记免疫染色。分析了三个独立实验中的五个区域，每个区域包含50到100个细胞。(B类)用空的、正常的和突变的TFEB质粒转染24小时后，定量聚合酶链反应（QPCR）分析TFEB靶基因的表达。(C类)对转染等量空（pcDNA）、WT-TFEB或TFEBS142A-3xFlag载体的HeLa细胞蛋白提取物中的LC3-II进行免疫印迹分析。在指定位置添加巴非霉素（400 nM，持续4小时）。将LC3-II水平的定量标准化为肌动蛋白水平。(D类)收获前24小时对稳定表达GFP-mRFP-LC3并转染pcDNA、WT-TFEB或TFEBS142A-3xFlag的HeLa细胞进行自噬体分析（AL=RFP阳性/GFP阴性）。(E类)体外激酶测定。重组激酶在[γ-32P] 三磷酸腺苷和TFEB蛋白（TFEB-S-142）的120到170个氨基酸的多肽，或用丙氨酸取代丝氨酸142的类似多肽（TFEB-a-142）。磷酸化效率以肽结合的放射性量来衡量。(F类)用ERK1/2特异性siRNA寡聚体或对照siRNA转染过表达TFEB的HeLa稳定克隆。48小时后，细胞未经治疗、血清饥饿或血清和氨基酸（a.a.）饥饿4小时；收获；进行核分离、Flag和H3免疫印迹。用ERK特异性抗体检测总裂解物。数值为至少三个独立实验的平均值±SEM。学生的t吨测试（未配对）*P（P）< 0.05,**P（P）< 0.001.
图4
图4
TFEB介导的自噬诱导的体内分析。(一和B类)2月龄WT小鼠感染AAV2/9 Tcfeb-HA并在处死前禁食16小时的TFEB亚细胞定位分析。(一)核HA信号的量化。HA-免疫荧光分析（红色）和DAPI染色（蓝色）；每个肝脏中计数100个转基因细胞。(B类)对接受核分离的肝脏标本中HA、微管蛋白和H3进行免疫印迹分析。用HA特异性抗体检测总肝裂解物，以验证喂食动物和禁食动物之间转基因表达的可比性。(C类)注射AAV Tcfeb HA或生理盐水（对照组）并随意喂食或禁食24小时后处死的2个月大的GFP-LC3转基因小鼠的冷冻保存肝切片中的GFP和DNA（DAPI）染色的免疫荧光。GFP阳性囊泡的定量如图所示。(D类)Alb-CRE肝蛋白提取物中LC3和肌动蛋白的免疫印迹分析，Tcfeb公司-3x标志，以及Tcfeb公司-3x标志；Alb-CRE小鼠。(E类)对从Alb-CRE分离的肝脏样本中自噬和溶酶体TFEB靶基因表达的QPCR分析，Tcfeb公司-3x标志，以及Tcfeb公司-3x标志；Alb-CRE小鼠。(F类)营养饥饿期间自噬溶酶体网络的磷酸依赖性TFEB调节模型。数值为平均值±SEM；每组至少分析5只小鼠；*对< 0.05,**P（P）< 0.001.
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