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.2011年5月17日；19(5):613-28.
doi:10.1016/j.ccr.2011.03.012。

亮氨酸剥夺后自噬的缺陷调节揭示了人黑色素瘤细胞在体内外的靶向性

Joon Ho Sheen公司 1, 罗伯托·佐恩库, Dohoon Kim先生, 大卫·M·萨巴蒂尼
附属公司

亮氨酸剥夺后自噬的缺陷调节揭示了人黑色素瘤细胞在体内外的靶向性

Joon Ho Sheen公司等。 癌细胞. .

摘要

自噬作为癌症治疗的靶点，越来越受到人们的关注。我们发现，亮氨酸缺乏导致黑色素瘤细胞的caspase依赖性凋亡死亡，因为它不能适当激活自噬。黑色素瘤中常见的RAS-MEK通路的过度激活阻止了亮氨酸剥夺对mTORC1的抑制，后者是营养丰富条件下自噬的主要阻遏物。在体内肿瘤异种移植模型中，无亮氨酸饮食和自噬抑制剂的结合可以协同抑制人类黑色素瘤的生长，并触发癌细胞的广泛凋亡。总之，我们的研究证明了结合自噬抑制和剥夺肿瘤亮氨酸的策略可以获得抗癌效果。

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数字

图1
图1。去亮氨酸诱导人黑色素瘤细胞凋亡
患者衍生黑色素瘤细胞（A）、永生化人类黑色素细胞和非黑色素细胞衍生系（B）以及转化黑色素细胞（C）的调查。在剥夺个体必需氨基酸48小时后，对指示细胞系的完整和裂解caspase-3进行免疫印迹分析。条形图显示了蛋白质质量（细胞生长和增殖的读数）和胱天蛋白酶-3激活百分比（裂解与全长胱天蛋白酶-3的比率）的相对变化。虚线表示caspase-3激活10%。Ctrl，控制RPMI-1640媒体；C-F-H-I-K-L-M-Q-R-T-V-W-Y，剥夺指定的单一氨基酸（氨基酸的单字母代码）；Adr，阿霉素2µg/ml。（D）Annexin-V凋亡诱导试验。FL1；膜联蛋白-V-荧光素，FL2；碘化丙锭，UR；右上象限，左后；右下象限。（E） 细胞存活分析。细胞被剥夺所有必需氨基酸（-EAA）、组氨酸（-His）、异亮氨酸（-Ile）或亮氨酸（-Leu）2天，然后重新放入对照RPMI-1640培养基中，并在指定的时间点测量细胞数量的变化。数据表示为平均值±标准差，*表示与对照组有显著差异的值。另请参见图S1。
图2
图2。通过线粒体凋亡途径激活caspase级联对亮氨酸缺乏诱导的死亡是必要的
（A） 在存在或不存在20µM Q-VD-OPH的情况下，显示所有必需氨基酸（-EAA）、异亮氨酸或亮氨酸缺失后形态变化的显微照片。比例尺=100µm。（B） 免疫印迹分析显示增加Q-VD-OPH浓度（0µM、5µM，20µM和100µM）对caspase介导的过程的剂量依赖性抑制作用。（C） 细胞存活分析。在存在或不存在泛酶抑制剂、20µM Q-VD-OPH或100µM Z-VAD-fmk的情况下，细胞被剥夺亮氨酸（-Leu）2天。（D） 流式细胞术分析显示使用JC-1染料的MOMP的变化。FL1；J单体（JC-1绿色荧光），FL2；J聚集体（JC-1红色荧光）。（E） 免疫印迹分析显示Bcl-xL表达对亮氨酸剥夺后caspase-3激活的影响。（F） 流式细胞术分析显示MOMP的变化。（G） 细胞存活分析。数据以平均值±标准差表示，*表示与对照组明显不同的值。
图3
图3。缺乏亮氨酸不会激活激活Ras-MEK信号的黑色素瘤细胞的自噬
（A） 显示自噬标记的荧光显微照片。控制，完成RPMI-1640介质控制；PBS，磷酸盐缓冲液-EAA，剥夺所有必需氨基酸，-Ile，剥夺异亮氨酸-亮氨酸缺乏。DAPI，细胞核；DsRed-LC3，DsRed-LC3点的红色荧光；GFP，来自未纯化的DsRed-LC3-GFP报告子的绿色荧光；DAPI、DsRed和GFP信号的合并图像。（B） DsRed-LC3点定量。条形图显示了每种类型的营养饥饿后每个细胞DsRed-LC3点的平均值±标准差。显示检查的细胞数量。（C） 自噬活性的流式细胞术分析。条形图显示了剥夺单个必需氨基酸24或48小时（n=3）后获得的自噬指数的平均值±标准差。虚线表示在对照培养基中培养的细胞的自噬指数。（D） PBS孵育后HEK-293T细胞的自噬指数或氨基酸缺失。（E） 自噬活性的流式细胞术定量。米，标记线，指示对照培养基中细胞FL1（GFP荧光）的中值荧光强度。（F） 条形图显示自噬指数的平均值±标准差（n=3），*表示与对照组有显著差异的数值。另请参见图S2。
图4
图4。组成活性MEK对mTORC1通路的去调节激活与mTOR在溶酶体表面的不当定位有关
（A） 免疫印迹分析显示，在剥夺所有必需氨基酸或亮氨酸后，mTORC1和自噬活性的时间依赖性变化。（B） 免疫荧光分析显示，在剥夺所有必需氨基酸（-EAA）或亮氨酸（-Leu）后，mTOR定位。短时间（50分钟）或长时间（4小时）剥夺细胞的指定氨基酸，并在处理mTOR（红色）和LAMP2（绿色）的联合免疫染色和成像之前，再次喂入氨基酸10分钟。在所有图像中，插图显示放大五倍的选定字段及其覆盖。比例尺=10µm。另请参见图S3。
图5
图5。自噬抑制与低亮氨酸浓度协同诱导黑色素瘤细胞凋亡
（A） 显示雷帕霉素（RAPA）或U-0126存在或不存在时自噬指数的条形图。（B–E）半胱天冬酶-3的裂解和激活以及PARP裂解的免疫印迹分析。（F–H）细胞存活试验。（一） 免疫印迹分析证实了shRNA-介导的ATG1敲除。（J） 的击倒自动液位计1表达的模仿效应光栅-G12V或MEK1-Q56P型在剥夺亮氨酸后使Mel-ST细胞对caspase-3激活敏感。（K） 免疫印迹显示，在存在或不存在氯喹的情况下，与减少的亮氨酸孵育的细胞中caspase-3和PARP裂解。（五十） 氯喹（CQ）使A-2058黑色素瘤细胞对部分亮氨酸缺乏敏感。免疫印迹显示并用图表定量显示caspase-3的激活与含有或不含氯喹的培养基中亮氨酸浓度的关系。（M） A-2058细胞在指定条件下培养2天的存活率。数据表示为平均值±标准差，*表示与对照组有显著差异的值。另请参见图S4。
图6
图6。在缺乏饮食亮氨酸并用自噬抑制剂治疗的小鼠中协同抑制黑色素瘤生长
（A） 用添加亮氨酸的等热量控制饮食（控制饮食）、控制饮食加氯喹（+CQ）、无亮氨酸饮食（-亮氨酸饮食）或无亮氨酸膳食加氯喹的等热量对照饮食喂养14天后切除的肿瘤异种移植物的照片。（B） 柱形散点图显示肿瘤的平均±标准体积。*指示与控件显著不同的卷。注释：在−亮氨酸饮食+CQ组中，肿瘤位于右侧第三位，呈扁平圆盘状，而不是其他组中的大肿瘤呈球形。因此，它在照片中看起来似乎很大。（C） 原位TUNEL分析。H+E，苏木精和伊红染色肿瘤切片的代表性显微图像；TUNEL，TUNEL分析中处理的肿瘤切片的代表性图像；TUNEL+H，苏木精复染TUNEL结果的代表性图像。比例尺=3 mm。（D）肿瘤切片的代表性高倍显微照片，显示TUNEL阳性、凋亡区域。比例尺=100µm。（E） 肿瘤内黑色素瘤细胞的凋亡与肿瘤毛细血管的距离有关，抑制自噬会显著缩小肿瘤毛细血管周围的活袖口。显微照片显示肿瘤切片的相应高倍和低倍图像，显示毛细血管（用箭头表示）和TUNEL阳性的凋亡区域。比例尺=100µm。
图7
图7。饮食缺亮氨酸和自噬抑制联合诱导黑色素瘤caspase-3激活体内
（A） 免疫组织化学分析显示胱天蛋白酶-3裂解体内H+E，用苏木精和伊红染色的肿瘤切片图像，其中毛细血管用箭头表示；TUNEL，用于TUNEL分析的肿瘤切片图像；D175裂解Caspase-3，肿瘤切片图像，用抗Asp-175位点特异性裂解Caspase-3抗体染色活性Caspase 3；D175裂解的Caspase-3+阻断肽，肿瘤切片图像，用预先与表位阻断肽孵育的抗Asp-175位点特异性裂解Caspase-3抗体染色活性Caspase-3；黑色素A，用人类黑素细胞特异性标记物抗黑色素A抗体染色的肿瘤切片图像。比例尺=100µm。（B） 肿瘤组织的代表性高倍显微照片，显示TUNEL阳性信号和D175裂解caspase-3阳性信号之间的地理相关性，毛细血管用箭头表示。比例尺=100µm。另请参见图S5。
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