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.2011年4月18日；193(2):275-84.
doi:10.1083/jcb.201102031。 Epub 2011年4月11日。

肝癌细胞中Nrf2通过p62持续激活

伊南义弘 1, 佐佐希·瓦古里, 坂本雅子, 津口口, 中田一郎, 奥基奥·日野, 渡边秀美, 金安藤, 岩田真武, 山本正彦, Myung-Shik Lee先生, 田中庆二, 小松正明
附属公司

肝癌细胞中Nrf2通过p62持续激活

伊南义弘等。 J细胞生物学. .

摘要

自噬的抑制总是伴随着选择性自噬底物p62的显著积累。由于p62与Keap1上的Nrf2结合位点相互作用，Keap1是一种基于Cullin 3的泛素连接酶适配器蛋白，因此自噬缺陷会导致Nrf2-Keap1相互作用的竞争性抑制，导致Nrf2稳定，随后Nrf2靶基因转录激活。在此，我们发现，肝脏特异性自噬缺陷小鼠体内存在与p62和Keap1阳性细胞聚集物的形成以及Nrf2靶点的诱导有关的腺瘤。重要的是，在25%以上的人肝细胞癌（HCC）中发现了类似的聚集物，并且在大多数这些肿瘤中发现了Nrf2靶基因的诱导。肝癌细胞系中p62的基因靶向显著消除了凤尾鱼非依赖性生长，而强制表达p62，但不是Keap1相互作用缺陷突变体，导致生长缺陷的恢复。这些结果表明Nrf2的持续激活通过p62的积累参与肝癌的发展。

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数字

图1。
图1。
损失附件7最终引发肝细胞腺瘤。（A） 肝脏大体解剖的年代变化附件7飞行/飞行;阿尔布-Cre公司和附件7飞行/飞行老鼠。箭头表示微肿瘤。棒材，1cm（B）H&E染色肝脏切片附件7飞行/飞行和附件7飞行/飞行;阿尔布-Cre公司4至12个月龄的小鼠。虚线：12个月大鼠肝脏中的肿瘤区域附件7飞行/飞行;阿尔布-Cre公司鼠标。插图显示了包含有丝分裂细胞的盒状区域的高倍视图（箭头）。C、 中央静脉；P、 门静脉。棒材，100µm。（C） 肝功能测试附件7飞行/飞行（蓝色条）和附件7上下;阿尔布-Cre公司（红条）小鼠，年龄4至12个月。测定血清天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶和碱性磷酸酶（ALP）水平。数据为的平均值±SD附件7飞行/飞行(n个=3）和附件7飞行/飞行;阿尔布-Cre公司(n个=4）4个月龄时附件7飞行/飞行(n个=3）和附件7上下;阿尔布-Cre公司(n个=3）在9个月龄时附件7飞行/飞行(n个=5）和附件7飞行/飞行;阿尔布-Cre公司(n个=5）12个月龄时。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。（D） 非肿瘤肝细胞（a和b）和肿瘤细胞（c和D）的电子显微镜附件7飞行/飞行;阿尔布-Cre公司小鼠肝脏。a和c中的方框区域被放大，分别显示为b和d。b中的插图显示过氧化物酶体的高倍视图（b中的方框区域）。注意周围区域有大量过氧化物酶体（星号）和变形线粒体（箭头）堆积。箭头：同心膜结构，持续存在于附件7-肝细胞缺乏。Nu，细胞核；五十、 脂滴。棒材：（a和c）5µm；（b和d）1µm。（E） 肝切片中COX活性的组织化学检测附件7飞行/飞行和附件7飞行/飞行;阿尔布-Cre公司4至12个月龄的小鼠。虚线：12个月大鼠肝脏肿瘤区域附件7飞行/飞行;阿尔布-Cre公司鼠标。棒材，10µm。（F） 磷酸组蛋白H2A。所示基因型12个月龄小鼠非肿瘤和肿瘤区域的X阳性细胞。箭头，磷蛋白组蛋白H2A阳性细胞。X.棒材，100µm。
图2。
图2。
Nrf2在附件7-肝细胞腺瘤缺陷。（A） 免疫印迹分析。对总、可溶性和不溶性部分进行SDS-PAGE分析，并用所示抗体进行免疫印迹分析。值得注意的是，LC3-I向LC3-II的转化减少，这意味着自噬体的形成有缺陷，这在肝脏的非肿瘤区域和肿瘤区域都得到了证实附件7-缺陷小鼠(附件7飞行/飞行;阿尔布-Cre公司). 数据来自三个独立的实验。（B） 免疫荧光分析。用抗p62和抗Keap1抗体对12个月龄小鼠的肝脏非肿瘤或肿瘤切片进行免疫染色。右栏显示Keap1（绿色）和p62（红色）的合并图像。每个插图都是装箱区域的放大图像。棒材，20µm。（C） qRT-PCR分析。从A所示的肝脏或肿瘤中制备总RNA。将数值标准化为附件7飞行/飞行4-mo-old（左）和12-mo-old小鼠（右）的肝脏。数据是三个实验的平均值±SD。**，P<0.01；***，P<0.001。
图3。
图3。
含有p62-和Keap1-阳性聚集物的人肝癌中Nrf2的激活。（A） 免疫组织化学图像。肝癌组织阵列的石蜡切片用抗p62或抗Keap1抗体染色。在26例HCC病例中，显示了6例含有典型包涵体。括号内有病理分级的病例代码显示在顶部。插图中显示了装箱区域的高倍视图。棒材：（面板）50µm；（插图）10µm。（B） 双重免疫荧光显微镜。用抗Keap1和抗p62抗体对三例含有典型包涵体的肝癌进行免疫染色。Keap1（绿色）和p62（红色）的合并图像显示在右侧。病理分级显示在左侧。棒材，10µm。（C） qRT-PCR分析。从15个HCC的非肿瘤和肿瘤区域制备总RNA。将数值标准化为B6非肿瘤区域的mRNA数量，其中p62-和Keap1-阳性聚集物未被识别。数据是三个实验的平均值±SD。
图4。
图4。
删除第62页抑制人肝癌细胞株的非锚定生长。（A） qRT-PCR分析第62页和编号1肝癌细胞系中。数值标准化为Hek293细胞中的mRNA数量。所示数据代表了三个单独的实验。（B） 免疫印迹分析。对所示细胞系的总裂解物进行SDS-PAGE，并用所示抗体进行免疫印迹分析。星号表示非特定带。数据来自三个独立的实验。（C） 核Nrf2的免疫印迹分析。从所示细胞系中制备核组分，进行SDS-PAGE，并用Nrf2和层粘连蛋白B抗体进行免疫印迹分析（作为对照）。数据来自三个独立的实验。（D） qRT-PCR分析。从JHH-5和JHH-6中制备总RNA_第62页−/−细胞。数值标准化为JHH-5细胞中的mRNA数量。（E） p62的免疫印迹分析。JOH-5和JHH-5的总裂解物_第62页−/−对细胞进行SDS-PAGE，并用p62和肌动蛋白抗体进行免疫印迹分析。（F） 双重免疫荧光显微镜。用抗p62和抗Keap1抗体对所示细胞系进行免疫染色。最下面一行：p62（绿色）和Keap1（红色）的合并图像。每个插图都是放大的图像。棒材，10µm。（G） 三维培养条件下Nrf2靶基因的qRT-PCR分析。从JHH5和JHH-5中制备总RNA_第62页−/−细胞在三维培养条件下。数值标准化为JHH-5中的mRNA数量。数据是三个实验的平均值±SD。***，P<0.001。（H） 软琼脂集落形成试验。JOH-5、JHH-5_第62页−/−和野生型p62或p62突变体（p62 T350A）–引入JH5_第62页−/−测试细胞在软琼脂中的生长能力。根据制造商提供的协议确定转换。RFU，相对荧光单位。数据是三个实验的平均值±SD。*，P<0.05；***，P<0.001。
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